Способ диагностики ящура методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

(51) 01 33/53 (2010.01) 01 33/569 (2010.01) 12 15/10 (2010.01) 12 15/42 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, точнее к молекулярной диагностике, и касается способа диагностики ящура методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров. Способ включает выделение РНК из патматериала,синтез кДНК,постановку полимеразной цепной реакции, при которой с использованием синтезированных специфических праймеров выявляют кДНК вируса ящура. Способ позволяет быстро (до 7 часов) и с высокой специфичностью диагностировать ящур. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Белоусов Вячеслав Юрьевич Строчков Виталий Михайлович Зайцев Валентин Лукьянович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 21375 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, точнее к молекулярной диагностике, и касается способа диагностики вируса ящура методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров. Известен способ диагностики болезни ящура с помощью метода обратной транскриптазной полимеразной цепной реакции. После проведения обратной транскрипции РНК, обеспечивающего синтез комлементарной ДМК (кДНК), проводят полимеразную цепную реакцию. В известном способе универсальные праймеры для всех серотипов синтезируют на нетранслируемую область. ПЦР продукт, образующийся в результате амплификации нетранслируемой области,составляет 328 п.н.(пар нуклеотидов). Амплификацию проводят при температурновременном режиме денатурация - 94 С, отжиг при 55 С -1 мин, элонгация при 72 С - 2 мин в течение 30 циклов. Недостатком данного способа является то, что длительный временной режим значительно увеличивает время проведения исследований (. 2000,-.-89.-р.167-176). Задачей является разработка высокочувствительного и эффективного метода диагностики вируса ящура на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способ диагностики ящура высокочувствительным и специфичным методом полимеразной цепной реакции позволяет точно и быстро (до 7 часов) диагностировать данное заболевание. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение вирусной РНК, синтез комлементарной ДНК (кДНК), синтез праймеров,постановку ПЦР, проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Выделение РНК из органно-тканевых материалов больных животных. Органно-тканевой материал мелко нарезают и помещают в ступку. Материал растирают с мелким стеклом до образования однородной массы, и добавляют физиологический раствор для получения 30-ной суспензии (вес/объм), а затем переносят в микроцентрифужные пробирки. Суспензию исследуемых проб подвергают трехкратному замораживанию при минус 40 С и оттаиванию, центрифугируют на центрифугев течение 2 мин на максимальной скорости. Супернатант переносят в чистые пробирки, а осадок отбрасывают. Выделение РНК из суспензии проводят с использованием раствора гуанидинизотиоцианата(ГИТЦ), добавляют 2,0 мл раствора ГИТЦ для разрушения клеток. Лизат клеток гомогенизируют в течение 30 секунД при комнатной температуре. К вируссодержащей суспензии добавляют 0,1 мл 2 М ацетата натрия, 1 мл фенола и 0,2 мл смеси 2 хлороформ/изоамиловый спирт на каждый миллилитр исходного раствора. Тщательно перемешивают на вортексе в течение 10 секунд и сразу переносят в лед на 15 минут. Суспензию центрифугируют при 10000 в течение 20 минут. Отбирают верхнюю водную фазу,РНК преципитируют равным объемом изопропанола в течение 1 часа при минус 20 С. РНК осаждают при 10 000 в течение 30 минут и осадок РНК растворяют 0,3 мл раствора ГИТЦ. Смесь тщательно перемешивают и РНК вновь осаждают равным объемом изопропанола с предварительным инкубированием в течение 1 часа при минус 20 С. РНК осаждали при максимальной скорости на центрифуге типав течение 10 минут. Осадок РНК дважды промывали 75 этанолом и растворяли в стерильной ДЕПС-воде. Синтез кДНК Обратную транскрипцию РНК проводят с использованием набора -, обеспечивающего синтез комлементарной ДНК (кДНК), в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Олигонуклеотидные праймеры Используя компьютерные пакетные программы конструируют специфические праймеры. Длина праймеров составляет 20-23 нуклеотидов. Данные праймеры ограничивают участок ДНК размером 290 п.н. Праймеры синтезируют на синтезаторе олигонуклеотидов. Полученные олигонуклеотиды элюиуют с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривают в вакуумном испарителе. Преципитат праймеров растворяют в ТЕ буфере и переосаждают этанолом,ресуспендируют в деионизированной воде и хранят при -20 С. Полученные таким образом синтезированные праймеры используют для постановки ПЦР. Проведение ПЦР Для постановки ПЦР используют специфические праймеры 3 и 3, амплифицирующие участок генома вируса ящура длиной 290 пар нуклеотидов. 3 53 3 513 Готовят общую реакционную смесь, исходя из того, что на одну реакцию необходимо 38,5 мкл Н 2 О 5 мкл 10 буфера (100 мМ ТрисНС, рН 8.3,500 мМ КС 1, 15 мМ 2, 0,01 ) 1 мкл дНТФ (10 мМ раствор дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) по 1 мкл каждого праймера с концентрацией 10 пмоль, 2,5 мкл фермента -полимеразы с концентрацией 1 ед/мкл. Тщательно перемешивают на вортексе, добавляют 1 мкл кДНК вируса ящура(50-500 нг/мкл) и наслаивают на поверхность по 2530 мкл минерального масла. Температурновременной режим,используемый при амплификации пре-денатурация, 94 С - 2 мин денатурация, 94 С - 20 сек отжиг, 55 С - 30 сек репликация, 72 С - 1 мин 21375 пост-репликация, 72 С - 7 мин Амплификацию продукта ПЦР осуществляют в течение 30 циклов. Наработку специфических участков ДНК проводят в термоциклере. Проведение электрофореза. Для учета результатов используют электрофорез в 2,0 агарозном геле. К продуктам амплификации с помощью автоматической пипетки добавляют 1 мкл буфера для нанесения проб, тщательно перемешивают пипетированием и по 10 мкл вносят в лунки геля. Визуализацию ДНК проводят в УФсвете. Документирование полученных результатов проводят при помощи фотографирования гелей в УФ-свете. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Способ диагностики ящура включает постановку полимеразной цепной реакции. Данный способ позволяет очень быстро (до 7 часов) проводить диагностику ящура. С этой целью у больных животных на анализ отбирают патматериал (афты, слюна), выделяют РНК, проводят синтез кДНК, затем амплификацию продукта ПЦР со специфическими праймерами 3 и 3. Визуализацию продуктов реакции проводят в УФсвете. Размер амплифицированного продукта определяют относительно маркера молекулярных масс, дополнительно сравнивают с положительным контролем. Способ диагностики ящура на основе полимеразной цепной реакции был успешно апробирован и прошел комиссионную проверку на базе Научно-исследовательского сельскохозяйственного института МОН РК. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики ящура, включающий выделение РНК вируса, проведение синтеза к ДНК,полимеразной цепной реакции (ПЦР) и детекцию продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле, отличающийся тем, что для постановки ПЦР используют специфические праймеры,амплифицирующие ДНК-фрагменты длиной 290 пар нуклеотидов.