Способ дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз методом полимеразной цепной реакции

(51) 12 15/10 (2010.01) 01 33/53 (2010.01) 01 33/569 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии,к молекулярной диагностике инфекционных заболеваний. Способ дифференциации включает выделение вирусной ДНК из вируссодержащего материала,синтез специфических олигонуклеотидных праймеров следующего состава-2-5-3, ограничивающий участок в 216 нуклеотидов на геномах вирусов оспы овец и оспы коз и содержащий сайт для рестриктазы Есо при оспе овец и отсутствие сайта для рестриктазы при оспе коз. Наработку ПЦР продукта проводят с помощью полимеразной цепной реакции и с последующей рестрикцией полученных фрагментов ДНК рестриктазой Есо. Дифференциацию вирусов оспы овец и оспы коз проводят на основе данных о количестве и размерах полученных рестрикционных ДНК фрагментов после проведения электрофореза в 2 агарозном геле, при котором в случае оспы овец получают две полосы ДНК размером 130 и 86 п.н., а при оспе коз только одну полосу размером 216 п.н. Данный способ позволяет точно проводить дифференциацию оспы овец и оспы коз и обладает высокой чувствительностью, способный выявлять до 2 пг вирусной ДНК в исследуемом материале.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Белоусов Вячеслав Юрьевич Строчков Виталий Михайлович Зайцев Валентин Лукьянович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИР УСОВ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 18656 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно, к молекулярной диагностике и представляет собой способ дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров. Известен способ дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз методом анализа нуклеотидной последовательности и ПЦР-ПДРФ Р 32 гена. При данном способе дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз объектом анализа является ген Р 32,характерный для всех геномов посквирусов, но имеющий различия по отдельным нуклеотидным последовательностям. Таким образом, ПЦР продукт,образующийся в результате амплификации гена Р 32 как при оспе овец, так и при оспе коз имеет размер 1025 п.н. (пар нуклеотидов). Рестриктазное расщепление ПЦР продукта при оспе овец ферментомприводит к образованию трех фрагментов ДНК размерами 300, 327 и 400 п.н., в то время как при расщеплении ПЦР продукта при оспе коз данной рестриктазой образуются два фрагмента размерами 327 и 697 п.н. Недостатком данного способа является образование большего количества фрагментов ДНК после расщепления ферментом,так при оспе овец образуются три фрагмента ДНК и при оспе коз - два, что значительно усложняет и увеличивает время проведения исследований (М., . , .-32 . //. 2004. .-29 .-.73-80). Задачей изобретения является разработка способа дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз методом полимеразной цепной реакции с последующим рестриктазным расщеплением ПЦР продукта, обеспечивающего быструю и точную дифференциацию близкородственных вирусов из патологического материала больных животных. Способ дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз методом полимеразной цепной реакции(ПЦР) включает амплификацию ДНК вирусов оспы овец и оспы коз с использованием синтетических праймеров, рестриктазное расщепление продукта ПЦР с последующей дифференциацией вирусов оспы овец и оспы коз по количеству и размеру фрагментов ДНК,при этом используют специфические праймеры -1 и -2 рестриктазное расщепление продукта ПЦР осуществляют с использованием эндонуклеазы рестрикциипри образовании в результате рестрикционного расщепления продукта ПЦР двух фрагментов ДНК размером 89 и 130 п.н. дифференцируют вирус оспы овец, а при образовании одного фрагмента ДНК размером 216 п.н. -вирус оспы коз. Способ осуществляют следующим образом Подготовка проб ДНК. Выделение вирусной ДНК из патматериала проводят следующим образом пораженный участок кожи от больного животного разрезают на мелкие кусочки стерильным скальпелем и растирают до гомогенного состояния в фарфоровой ступке. Суспензию 2 замораживают до минус 70 С и вновь растирают в ступке,процедуру повторяют трижды. Последующие этапы выделения используют также при выделении ДНК вирусов из инфицированных культур клеток. Вируссодержащую суспензию центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин,осадок отбрасывают, надосадочную жидкость используют для выделения вирусной ДНК. К вируссодержащей суспензии добавляют ДСН до конечной концентрации 0,5 и протеиназу К до 1 мкг/мл. Смесь инкубируют 2 ч при 37 С. К смеси добавляют равный объем фенола, осторожно перемешивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Водную фазу отделяют и обрабатывают равным количеством смеси фенол хлороформ - изоамиловый спирт в соотношении(25241), перемешивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. К водной фазе добавляют равный объем хлороформа,перемешивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Для осаждения ДНК вируса в водную фазу добавляют 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 2,5 объема 100 этанола. Затем раствор центрифугируют 30 мин при 10 000 об/мин. Осадок ДНК промывают 75 этанолом, растворяют в ТЕ буфере. Специфические праймеры конструируют на геномы вирусов оспы овец и оспы коз при помощи компьютерной программы 3, синтез отобранных праймеров проводят на синтезаторе олигонуклеотидов 8909,. В результате скрининга олигонуклеотидов для постановки ПЦР отобраны два праймера -1 и-2. -1 праймер размером в 20 нуклеотидов имеет последовательность 5-3, а праймер -2 размером 20 нуклеотидов последовательностью 5-31. Реакцию полимеразной цепной реакции проводят на термоциклере 9700,. Оптимальными условиями постановки метода ПЦР являются следующие параметры пре-денатурация - 95 С - 5 мин денатурация - 95 С - 10 сек отжиг -50 С- 10 сек репликация - 72 С - 10 сек пост-репликация 78 С - 15 мин. Реакцию проводят в течение 35 циклов. При постановке ПЦР на оспу овец с праймерами-1 и -2 образуется продукт амплификации размером 216 п.н. и сайтом рестрикции для ректриктазы Есо,при оспе коз в последовательности ДНК фрагмента нет сайта для данной рестриктазы. Анализ продуктов амплификации и рестриктазного расщепления проводят в 2 агарозном геле в присутствии бромистого этидия, в лунке с пробой ДНК оспы овец наблюдаются две полосы размерами 130 и 86 п.н, а в лунке с пробой ДНК оспы коз - одна полоса размером 216 п.н. Чувствительность разработанного метода ПЦР при идентификации вируса оспы овец достигает 2 пг ДНК. 18656 Способ дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз на основе полимеразной цепной реакции был успешно апробирован и прошел комиссионную проверку на базе Научно-исследовательского сельскохозяйственного института МОН РК. Предложенный способ обеспечивает быструю и тонкую дифференциацию вирусов оспы овец и оспы коз. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ дифференциации вирусов оспы овец и оспы коз методом полимеразной цепной реакции(ПЦР), включающий амплификацию ДНК вирусов оспы овец и оспы коз с использованием синтетических праймеров,рестриктазное расщепление продукта ПЦР с последующей дифференциацией вирусов оспы овец и оспы коз по количеству и размеру фрагментов ДНК,отличающийся тем, что используют праймеры,имеющие нуклеотидные последова тельности-2-53 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рестриктазное расщепление продукта ПЦР осуществляют с использованием эндонуклеазы рестрикции Е . 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при образовании в результате рестрикционного расщепления продукта ПЦР двух фрагментов ДНК размером 89 и 130 п.н. дифференцируют вирус оспы овец, а при образовании одного фрагмента ДНК размером 216 п.н. - вирус оспы коз.