Способ выделения нативной рнк вируса чумы мелких жвачных животных (чмжж) из вируссодержащего материала для постановки полимеразной цепной реакции (пцр)

(51) 12 15/10 (2010.01) 12 15/45 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к методам выделения РНК, и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для выделения высокомолекулярной РНК из вируссодержащего материала, пригодной для постановки полимеразной цепной реакции. Способ выделения нативной РНК вируса чумы мелких жвачных животных(ЧМЖЖ) из вируссодержащего материала для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) включает денатурацию клеточных белков и лизиса клеток 4 М гуанидинизотиоцианатом,предварительное осаждение изопропиловым спиртом,с дополнительной обработкой денатурирующим агентом 4 М гуанидинизотиоцианатом и осаждение РНК охлажденным этанолом. Способ выделения нативной РНК из вируссодержащего материала позволяет получать препараты высокоочищенной РНК, упростить процедуру, снизить трудоемкость и удешевить способ выделения нативной РНК из вируссодержащего материала.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Зайцев Валентин Лукьянович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НАТИВНОЙ РНК ВИРУСА ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ(ЧМЖЖ) ИЗ ВИРУССОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к методам выделения РНК, и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для выделения высокомолекулярной РНК из вируссодержащего материала,пригодного при постановке полимеразной цепной реакции. Известен способ выделения РНК из вируссодержащего материала гуанидинизотиоцианат-фенол-хлороформной экстракцией. При данном методе вируссодержащая суспензия обрабатывается лизирующим раствором 6 М гуанидинизотиоцианат, 0,1 М цитрат натрия, 0,5 саркозил, 0,1 М бета-меркаптоэтанол. Недостатком данного способа является его трудоемкость,многоступенчатость, не-воспроизводимость результатов, наличие примесей в РНК ( .. // . . - 1987. -162.-.156-159). Задачей изобретения является разработка способа выделения высокомолекулярной нативной РНК из вируссодержащего материала, для постановки и полимеразной цепной реакции,обеспечивающего получение высокоочищенного препарата нативной РНК, позволяющего упростить процедуру, снизить трудоемкость и удешевить способ выделения нативной РНК из вируссодержащего материала. Процедура обнаружения вируса на основе полимеразной,цепной реакций обязательно включает этап выделения вирусной РНК и требует ее выделения в чистом, нативном состоянии из вируссодержащего материала. Вирионы парамиксовирусов имеют весьма сложную структурную организацию и крупные размеры, с молекулярной массой генома, превышающей 15 кД. Сложная структурная организация вируса создает значительные трудности для выделения РНК из его вирионов и от этого во многом зависит степень чистоты полученного препарата. Способ выделения РНК из вируссодержащего материала включает гуанидинизотиоцианат-фенолхлороформную экстракцию вируссодержащего материала, при этом экстракцию вируссодержащего материала осуществляют последовательно раствором 4 М гуанидинизотиоцианата и смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта, после чего осаждают РНК изопропиловым спиртом и растворяют осадок раствором 4 М гуанидинизотиоцианата с последующим осаждением РНК, охлажденным ацетоном. Способ осуществляют следующим образом Используемый в работе вируссодержащий материал должен быть с титром инфекционности не ниже 7,0-7,5 ТЦД 50/см 3. К вируссодержащему осадку добавляется 1 мл 4 М гуанидинизотиоцианата приготовленного на растворе, содержащем 0,1 М цитрата натрия, 0,8 саркозила и 0,2 мМ бета-меркаптоэтанола. Перемешивается и оставляется при комнатной температуре на 10 мин. Затем 500 мкл гомогената переносится в пробирку на 1,5 мл и добавляется 300 мкл водонасыщенного фенола и 300 мкл хлороформа с изоамиловым спиртом (241). Содержимое пробирки перемешивается и выдерживается 20 мин при 10 С. Центрифугируется 10 мин при 14000 об/мин. Водная фаза переносится в другую пробирку,добавляется изопропиловый спирт в равном объеме и оставляется на 2 часа при -20 С. Проба центрифугируется 15 мин при 14000 об/мин. Осадок растворяется в 300 мкл 4 М гуанидинизотиоцианата, добавляется 1/10 объема 3 М ацетата натрия рН 5,5 и 2,5 объма охлажденного этанола и помещается при -20 С. Центрифугируется 15 мин при 14000 об/мин. Надосадок удаляется, а осадки промываются в 1 мл 70 этанола. Осадок высушивается и растворяется в 50 мкл 0,1 ДЭПК-содержащей стерильной воде. После этого проба РНК вируса ЧМЖЖ пригодна для проведения ПЦР. Оценку выделенной РНК вируса ЧМЖЖ проводили с помощью электрофореза в 0,8 геле агарозы с использованием трис-боратной буферной системы. Изложенное выше позволяет утверждать, что по величине выхода, степени очистки и нативности получаемых препаратов предложенный способ экстракции РНК вируса превосходит другие варианты, а также заметная экономия времени делают его простым и удобным. На основании приведенных данных можно сделать заключение о том, что описанный способ выделения РНК превосходит прототип, по основным параметрам. Многоразовую обработку препарата РНК фенолхлороформом (11) замен обработкой 4 М гуанидинизотиоцианатом. Совмещение некоторых этапов снижает трудоемкость и приводит к удешевлению способа выделения нативной РНК вируса ЧМЖЖ, обеспечивает получение препарата РНК без примеси. Диагностика данного заболевания на основе ПЦР-анализа основаны на выявлении геномной РНК вируса ЧМЖЖ и соответственно, требует ее выделения в чистом, нативном состоянии из вируссодержащего материала. Способ выделения нативной РНК вируса чумы мелких жвачных животных(ЧМЖЖ) из вируссодержащего материала для постановки полимеразной цепной реакции включает использование этапов денатурации клеточных белков и лизиса клеток 4 М гуанидинизотиоцианатом,предварительного осаждения изопропиловым спиртом, с последующей дополнительной обработкой денатурирующим агентом 4 М гуанидинизотиоцианатом и осаждением РНК охлажденным этанолом. С этой целью к вируссодержащему материалу с титром инфекционности 7,0-7,5 ЦД 50/см 3 добавляется 1 мл 4 М гуанидинизотиоцианата приготовленный на растворе, содержащем 0,1 М цитрата натрия,0,8 саркозила и 0,2 мМ бета-меркаптоэтанола. Затем гомогенат обрабатывается фенолхлороформом (11). После центрифугирования к водной фазе добавляется изопропиловый спирт в равном объеме и оставляется на 2 часа при -20 С. После центрифугирования осадок растворяется в 4 М гуанидинизотиоцианате, добавляется 1/10 объема 3 М ацетата натрия рН 5,5 и 2,5 объма охлажденного этанола и помещается при -20 С. После центрифугирования осадок промывается 70 этанолом, высушивается и растворяется в 50 мкл 0,1 ДЭПК-содержащей стерильной воде. Предложенный способ позволяет получать препараты высокоочищенной РНК, обеспечивает упрощение, снижение трудоемкости при выделении нативной РНК вируса чумы мелких жвачных животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выделения РНК из вируссодержащего материала, включающий гуанидинизотиоцианатфенол-хлороформную экстракцию вируссодержащего материала, отличающийся тем,что экстракцию материала содержащего вирус чумы мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) осуществляют последовательно раствором 4 М гуанидинизотиоцианата и смесью фенола,хлороформа и изоамилового спирта, после чего осаждают РНК изопропиловым спиртом и растворяют осадок раствором 4 М гуанидинизотиоционата с последующим осаждением РНК охлажденным ацетоном.