Набор синтетических олигонуклеотидов для определения ДНК геномодифицированной кукурузы линий Т25 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени

(51) 12 19/30 (2011.01) 12 1/68 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ кукурузы в ПЦР-лабораториях, так и в научноисследовательских целях. Задача изобретения разработка набора синтетических олигонуклеотидов для обнаружения ДНК генетически модифицированной кукурузы линий Т 25. Технический результат может быть достигнут путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трансгенной линий кукурузы включающего в себя праймеры и пробы. Создают набор синтетических олигонуклеотидов,выявления ДНК трансгенной кукурузы линии Т 25,включающие праймеры 5-3, 5- -3 и пробу 5- -31, где 1 означает присоединенный к 3 концевому нуклеотиду гаситель флуоресценции,,присоединенный к нуклеотиду Т. Результат, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение ДНК трансгенной кукурузы линии Т 25 в растениях, продуктах питания и кормах для животных. Достижения технического результата заключается в том, что набор синтетических олигонуклеотидов позволяет обнаружить ДНК генетически модифицированной кукурузы линии Т 25 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.(72) Турганбаева Асия Каирбековна Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Рашиденова Жазира Алимкуловна Старцев Вениамин Александрович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК ГЕНОМОДИФИЦИРОВАННОЙ КУКУРУЗЫ ЛИНИЙ Т 25 МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству,биотехнологии, молекулярно-генетической диагностике генетически модифицированных растений и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК генетически модифицированной кукурузы линии Т 25 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано для экспресс-диагностики генетически модифицированной Изобретение относится к сельскому хозяйству,биотехнологии,молекулярно-генетической диагностике генетически модифицированных растений и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК генетически модифицированной кукурузы линии Т 25 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано для экспресс-диагностики генетически модифицированной кукурузы в ПЦР-лабораториях,так и в научно-исследовательских целях. Развитие и совершенствование методов генетической инженерии, а также разработка методов переноса генетического материала в растительную клетку и методов восстановления в условияхиз отдельных клеток полноценных трансформантов,позволило модифицировать геномы многих видов растений. Технология создания трансгенных растений основана на переносе генов из различных гетерологичных систем (вирусов, микроорганизмов, животных,человека), поэтому трансгенные растения можно рассматривать как яркий пример преодоления физических,эволюционных и генетических барьеров,изолирующих геномы различных организмов. В результате проведения первых полевых испытаний трансгенных растений, в мире открылись значительные перспективы использования генной инженерии в сельском хозяйстве. Методы генетической инженерии все шире используют для изменения агротехнических свойств растений с целью их улучшения. В связи с этим, возникла необходимость в регулировании использования генно-инженерных технологий в сельском хозяйственном производстве на законодательном уровне во многих странах мира. Все пищевые продукты,корма,сырье из генетически модифицированных источников относятся к категориям, в отношении которых обязательным условием реализации на рынке является проведение исследований на качество и безопасность. Большинство предлагаемых методов анализа ГМИ направлено на использование в качестве первичного этапа тестирования исходных сортов трансгенных растений, которые являются донорами новых генов. Используемые сегодня в сельском хозяйстве трансгенные сорта растений отличаются от родительского сорта наличием белка,определяющего новый признак и гена, который кодирует синтез этого белка. Оценка безопасности как самих трансгенных растений, так и продуктов,полученных на их основе, сводится к исследованию рекомбинантной ДНК. Методика определения ГМИ основана на выявлении при помощи метода полимеразной цепной реакции специфических нуклеиновых последовательностей синтетических конструкций ДНК, присутствие которых в анализируемой ДНК однозначно свидетельствует о ее генно-инженерном происхождении. Следуя из этого, необходимо наладить методы экспресс диагностики генетически 2(ГМО) в лабораторных условиях. Для детекции ГМО в этих случаях используется метод основанный на полимеразной цепной реакции(детекция трансгенной ДНК). ПЦР в реальном времени лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации количества данной молекулы ДНК. Выявление последовательностимишени происходит в режиме реального времени за счт флуоресцентно меченых праймеров и не требует дополнительной стадии гель-электрофореза. Уникальность данного метода заключается в возможности проводить точный количественный анализ содержания ГМО. Разработан набор синтетических олигонуклеотидов для диагностики линии Т 25 кукурузы с применением метода ПЦР в режиме реального времени. Аналог изобретения. Известна работа Гудова В.П. Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени в которой предложен подход по созданию отечественной методической и компонентной базы для производства зондов для ПЦР в реальном масштабе времени, необходимых для решения различных биотехнологических задач с применением данного метода. В патенте РФ 2004 Г.2259401 Сухая смесь реагентов для полимеразной цепной реакции и способ проведения ПЦР анализа. В изобретении представлен способ получения сухой смеси реагентов путем лиофильного высушивания водного раствора, содержащего ДНК-полимеразу,дезоксинуклеозидтрифосфаты,буферные компоненты, краситель для электрофореза, глюкозу, инулин и -маннитол, пригодную для проведения ПЦР анализа генетически модифицированных источников. Аналог имеет следующий недостаток детекция результатов ПЦР производится с помощью электрофореза в агарозном геле, что отражается на низкой производительности данного анализа, более того,этот метод обладает низкой чувствительностью,характерной для электрофоретического разделения продуктов ПЦР в агарозном геле. Преимущества изобретения заключается в использовании набора синтетических олигонуклеотидов и пробы для диагностики линии Т 25 кукурузы с применением метода ПЦР в режиме реального времени, подобранных в результате программного анализа области вставки таким образом, что обеспечивают высокую специфичность выявления целевой последовательности трансгенной вставки линии кукурузы Т 25, смещение флуорофора в пробе в его центр позволяет снизить уровень фоновой флуоресценции,а при прохождении ПЦР увеличить чувствительностью метода выявления трансгенной вставки. Задача изобретения - разработка набора синтетических олигонуклеотидов для обнаружения ДНК генетически модифицированной кукурузы линии Т 25. Технический результат может быть достигнут путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трансгенной линий кукурузы включающего в себя праймеры и пробы. Создают набор синтетических олигонуклеотидов, выявления ДНК трансгенной кукурузы линии Т 25, включающие праймеры 5-3-1, где 1 означает присоединенный к 3-концевому нуклеотиду гаситель флуоресценции,- флуоресцентный краситель ,присоединенный к нуклеотиду Т. Результат, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение линий трансгенной кукурузы в растениях, продуктах питания и кормах для животных. Достижения технического результата заключается в том, что работа над созданием праймеров и пробы (зонда), которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом. Пример 1. Подготовка к работе 1. С помощью открытых, коммерческих баз данных научноисследовательских статей выбираются наиболее релевантные для выявления данной трансгенной линии праймеров и зондов,либо на основе анализа баз данных нуклеотидных последовательностей геномов растений,геномодифицированных трансгенных вставок, либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого объекта выбирается участок генома, уникальный для данной трансгенной линии. 2. Используются либо готовые праймеры и зонды, либо с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера и один зонд). Для этого секвенированная последовательность выравнивается с гомологичными последовательностями(близкородственных растений) и подбираются праймеры уникальные для искомой последовательности. 3. Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре. Зонд метится красителем(карбоксифлуоресцеин) через тимин в центральной части зонда. Точная позиция рассчитывается с помощью специальной программы. С 3-конца зонд метится гасителем флуоресценции 1. Зонд служит для визуализации ПЦР продукта и отражения динамики его накопления. 4. С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для выявления линии трансгенной кукурузы. Результат, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение ДНК трансгенной кукурузы линий Т 25 в растениях, продуктах питания и кормах для животных. Пример 2. ПЦР набор синтетических олигонуклеотидов Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК трансгенной кукурузы включающего в себя праймеры и пробы Трансгенная линия кукурузы Т 25 Праймеры 5- -3 5--3 Проба 53 где 1 означает присоединенный к 3 концевому нуклеотиду гаситель флуоресценции,флуоресцентный краситель ,присоединенный к нуклеотиду Т. Пример 3. Составная часть набора следующих веществ Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ. 1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные трансгенной области линии Т 25 кукурузы,смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов,реакционный буфер (100 мМ - ( 8.8 при 25 С), 500 мМ КС 1, 0.8 Р 40, 20 мМ 2),внутренний контрольный образец (ВК). Праймеры представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к трасгенной области линии Т 25 кукурузы, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации(наработки) продукта, проба (зонд) служит для визуализации ПЦР-продукта в режиме реального времени. Краситель и тушитель в зонде находятся в тесном взаимодействии, гаситель препятствует флуоресценции красителя. За счет 5- 3 экзонуклеазной активности -полимеразы при синтезе ПЦР-продукта происходит высвобождения красителяи его флуоресценция, что фиксируется детектирующим прибором. Внутренний контрольный образец(ВК) представляет собой ДНК- последовательность,вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб. 2) Раствор фермента -полимеразы. 3) Положительный контрольный образецДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом трансгенной вставки. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при положительной реакции. Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными. 4) Отрицательный контрольный образецобразец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов 3 продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент. Пример 4. Подготовка к проведению реакции ПЦР в реальном времени Данный набор применяется следующим образом. 1) Анализируемые образцы (растения, продукты питания и корма для животных) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, который не является предметом данного патента) в ходе этой процедуры из анализируемых образцов выделяется ДНК,которую в свою очередь используют для ПЦР. 2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов. 3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор полимеразы. 4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К- (отрицательный контрольный образец),К(положительный контрольный образец вносится выделенная согласно п.1) ДНК. 5) В пробирку, маркированную К- вносится отрицательный контрольный образец. 6) В пробирку, маркированную К вносится положительный контрольный образец. 7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно следующей программе 1 цикл 94 С - 600 секунд, 50 циклов 94 С - 15 секунд, 60 С - 60 секунд, 1 цикл 72 С - 10 минут. Используется амплификаторы в режиме реального времени. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору. В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается,что ведет к возрастанию уровня флуоресценции,который фиксируется специальными приборами детектирующими амплификаторами. Таким образом в лабораториях и в научноисследовательских целях рекомендуем использовать набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК генетически модифицированной кукурузы линии Т 25 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Пример 5. Определение генетически модифицированных организмов методом ПЦР в режиме реального времени В основе метода ПЦР в реальном времени лежит изменение сигнала флуоресценции в ходе реакции. Это изменение происходит благодаря использованию специфического для искомой ДНК зонда, который, подобно праймеру, в ходе реакции связывается с одной из цепей ампликона. Зонд содержит на 5 конце флуоресцентный краситель, а на 3 конце - гаситель флуоресценции. В ходе синтеза комплементарной цепи, благодаря 5-3 нуклеазной активностиДНК-полимеразы, зонд расщепляется. После расщепления происходит разобщение красителя и гасителя, что приводит по мере накопления продукта реакции к возрастанию сигнала флуоресценции. Изменение сигнала флуоресценции позволяет проследить кинетику ПЦР и использовать полученные данные для расчета значения порогового цикла - величины, позволяющей судить об исходном количестве копий ДНК и сравнивать образцы между собой. Например, протестированы образцы соевой муки(5-10) с использованием тест-системы, которая позволяет выявить одновременно ДНК сои и наиболее распространенные генетически модифицированные последовательности промотора 35 вируса мозайки цветной капустыи терминатораТ 1 плазмиды. В качестве анализируемых образцов исследовали соевую муку. В процессе реакции ПЦР в реальном времени показаны кинетические кривые амплификации ДНК сои по каналу(фиг.1). На фиг.2 кинетические кривые амплификации фрагмента П-35 промотора и Т- терминатора по каналамисоответственно. При идентификации были обнаружены регуляторные последовательности промотора и терминатора в соевой муке (6). Таким образом в результате ПЦР анализа были обнаружены регуляторные последовательности промотора 35 и терминаторав соевой муке. Присутствие регуляторных элементов свидетельствует о генетической модификации генома сои. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Набор синтетических олигонуклеотидов для определения ДНК геномодифицированной кукурузы линий Т 25 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающий реакционную смесь с праймерами и пробой, специфичной трансгенной области линии Т 25 кукурузы, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов,реакционный буфер, раствор фермента полимеразы, отличающийся тем, что используют флуоресцентно-меченные праймеры 53,5