Штамм Pseudomonas aeruginosa G23 предназначенный для биодеструкции жиров

(51) 12 15/78 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности,к получению нового штамма биодеструктора жиров отличающегося биологической активностью к маслам и жирам животного происхождения. Новый штамм бактерий вида .23,обладает высокой липолитической и окислительной активностью (4936,3 ед) по отношению к жирам растительного и животного происхождения. Культура демонстрирует биодеструкцию оливкового масла до 87,77. При деструктировании животных жиров разложение происходит до конечной концентрации 12-20 в течение 6 суток. Данный штамм рекомендуется в качестве основы биопрепарата для локальной очистки жиросодержащих вод.(72) Кожахметов Самат Серикович Сармурзина Зинигуль Сериковна Тыныбаева Индира Кажымухановна Кирибаева Асель Калиаскаровна Гаджимурадова Айсарат Махмудовна Ануарбекова Сандугаш Сакеновна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Республиканская коллекция микроорганизмов Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ 23 ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ БИОДЕСТРУКЦИИ ЖИРОВ Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоактивного штамма для очистки сточных вод от жиров. Развитие пищевых предприятий и расширение рынка сетей общественного питания сделало особенно актуальным решение проблемы очистки сточных вод этих предприятий,пищевой промышленности от жиров, масел, белков и других органических загрязнений. Серьезной проблемой является удаление отложения жиров в канализационных системах данных предприятий и утилизация жира. Изобретение представляет собой штамм 23,обладающий высокой липолитической активностью по отношению к жирам животного и растительного происхождения. Наиболее близким к заявляемому штамму прототипом является штаммИБ 2-2 (Патент 2310685 С 12 9/20). Утилизацию свиного жира проводили путем периодического выращивания штаммаИБ 2-2 в колбах на качалке при 200 об/мин, объем среды 100 мл. Состав питательной среды соевая мука - 5 дрожжевой экстракт - 60 К 2 НР 04 - 5,0 (4)2 4 - 1,0 среды 7,0,температура выращивания 28 С. Время выращивания 40 час. Исходное содержание свиного жира составляло 1 мас По окончании процесса ферментации штамма .ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 4,09 10 КОЕ/мл, а деструкция свиного жира - 100. Утилизацию говяжьего жира проводят аналогично путем периодического выращивания штамма .ИБ 2-2 в колбах на качалке при параметрах процесса и составе питательной среды, приведенных выше. Время выращивания 51 час. Исходное содержание говяжьего жира составляет 1 мас По окончании процесса ферментации штамма . ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,09 10 КОЕ/мл, а деструкция говяжьего жира - 100. Недостатками данного метода является не достаточная изученность деструкции более высоких концентраций жиров. У полученного нами штамма изучены деструкции более высоких концентраций жиров. Выявлено, что штамм деструктирует до 10 мас. жиров. Известен способ очистки сточных вод,содержащих остатки пищевых масел и жиров,который предусматривает обработку биопрепаратом на основе культур бактерийМ 2,М-3,4,М-5 в присутствии источников азота, фосфора, калия и микроэлементов при 10-50 С ( 2161595, 2001). Однако способ является сложным,требует использования специального биопрепарата, к тому же твердые жиры с трудом поддаются переработке микроорганизмами. Полученный нами штамм не обладает данным недостатком и деструктирует твердые жиры. Известен способ переработки отходов производства пальмового масла, заключающийся в том, что жидкие и твердые отходы подвергают жидкофазной и твердофазной ферментации с использованием селекционированной культуры бактерийМ-1 ( 2161415,2001). Однако этот способ требует создания установки,кроме того, при его использовании стоит проблема утилизации отработанного активного ила,содержащего жир. Полученный нами штамм не требует строгого подбора условий и специального оборудования. Близким изобретением является патент 4009806 С 1, 14.11.91, заключающийся в использовании культур следующих бактерий, , , . В указанном патенте констатируется факт спонтанного роста бактерий на остатках пищевых масел и жиров при этом естественно отмечается разрушение данными бактериями пищевых масел и жиров. Недостатком аналога является также и то, что среди описанных микроорганизмов имеются как аэробы, так и анаэробы и факультативные анаэробы. Патентуемый нами штамм является монокультурой и не требует анаэробных условий. Известен штамм. 1 (. (. .) 36261 - 267 (2002 выделенный из жиросодержащих сточных вод деградирующий 5 пальмовое масло. Недостатком данного метода является не достаточная изученность деструкции более высоких концентраций жиров и низкая деструктирующая активность штамма 67.25. У полученного нами штамма изучены деструкции более высоких концентраций жиров. Выявлено, что штамм деструктирует до 10 мас. жиров. Задачей данного изобретения является получение штамма микроорганизмов обладающего высокой липолитической и окислительной активностью по отношению к жирам растительного и животного происхождения. Результат достигается предлагаемым штаммом . 23,выделенным из образца жиросодержащих сточных вод, мясокомбината г. Астана. Выделение производилось методом истощающего штриха на среде СПА. Состав среды пептон ферментативный,сухой для бактериологических целей - 9,0 г гидролизат казеина ферментативный, неглубокой степени расщепления - 8,0 г дрожжевой экстракт - 3,0 г хлорид натрия - 5,0 г натрий гидроортофосфат 2,0 г. агар микробиологический - 10 г(7,20,2). Штамм поддерживается в музее РГП Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК. Штамм .23 характеризуется следующими морфологические признаками. Клетки грамотрицательные палочковидные подвижные прямые или изогнутые палочки с закруглнными концами 1-5 х 0.5-1,0 мкм. При культивировании среда окрашивается в сине-зелный цвет и обнаруживается помутнение и пленка. Оптимальная температура роста - 37 С. Штамм хранится на косяках СПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 24 месяца, а также в лиофильно-высушенном и криоконсервированном состоянии. Штамм идентифицирован по определителю. Анализ штамма путем секвенирования двух фрагментов гена 16 РНК и последующее сличение этих фрагментов со всеми известными последовательностями,депонированными во Всемирной базе генов , подтвердили достоверность идентификации. Последовательность фрагмента гена 16 рРНК. ССТАСТСАТС СТТААСТТ СТТААСААСС ТТСТТСАСАСТС ТА ТТСААСАА АААСТАСТТА Штамм отличается от ранее выделенных и референс последовательности .наличием следующих полиморфизмов в генеА 466 , 501 , 576 , 610 , 633 ,679 . Полиморфизм 679 приводящей к замене серина на пролин (/) в 227 положении. Для штамма .23 проведена оптимизация параметров повышения липазной активности. Установлено, что оптимальными параметрами для максимальной активности в лабораторных условиях являются количество инокулята - 5, время культивирования - 24 ч, рН 9,0, температура 37 С и скорость перемешивания 150 об/мин. Проведена предварительная очистка липолитических ферментов из супернатанта культуральной жидкости .23,получены 8 значимых фракций. Проведено изучение активности полученных хроматографических фракций. Выявлено, что наибольшей активностью обладает фракция Е 4,электрофоретическое разделение которой показало наличие протеинов молекулярной массой 7, 10, 17, 29 Да, последний из которых предположительно может соответствовать липазе . Новый штамм бактерий вида .23,выделенный из жировых отложений, обладает высокой липолитической и окислительной активностью (4936,3 ед) по отношению к жирам растительного и животного происхождения. В условиях шейкера .23 деструктирует животные жиры до конечной концентрации 12-20 в течение 6 суток. Причем разложение говяжьего жира, происходит быстрее и уже на 5 сутки составляет 45 от внесенной массы. Культура деструктировала говяжий жир до остаточной массовой доли 12, тогда как свиной жир она деструктировала до 20, несмотря на то,что свиной жир более подвержен эмульгированию,чем говяжий. При культивировании .23 в условиях термостата деструкция говяжьего и свиного жиров происходит до конечной концентрации 35 и 39 соответственно. С целью максимального приближения к нативным условиям проведена деструкция поверхностной жировой фракции жироуловителя в лабораторных условиях. В результате получены следующие данные прирост биомассы культуры .23 в условиях шейкера наблюдался до 5 9 суток (максимальное значение КОЕ/мл 2,3710 ). В стационарных, условиях (термостат), культура демонстрировала прирост биомассы только до 3 9 суток (максимальное значение КОЕ/мл 1,7510 ). Определение массовой доли жира показало деградацию жира до 49,5 от общей концентрации жира в среде, что снизило его концентрацию в 1,98 раз. Тогда как, культура, инкубированная в шейкере,снизила концентрацию жира в общем объеме среды до 61,2 от общей концентрации жира и уменьшила его содержание в 2,58 раз. Проведены исследования деградации жиров в нативных условиях. Для этого культура высокоактивного штамма .23 была наработана в ферментере/ при непрерывном способе ферментации в количестве 10 8 л с концентрацией 2,110 КОЕ/мл. Для проведения эксперимента в пластиковую емкость (опытную) объемом 50 л вносились вода(37 С), жир из жироуловителя и культуральная жидкость .23 в соотношение 8/1/1 соответственно. Контролем служила аналогичная емкость с внесенным в воду жиром из жироуловителя в соотношение 9/1. Измеряемыми параметрами служили остаточная масса жира. Эксперимент проводился при средней температуре окружающей среды 22,5 С, температуре земли на участке закладки эксперимента 15,3 С, температуре в емкости 15,3 С,смеси от 6,5 до 5,7. В результате проведенных работ выявлено, что штамм .23 разлагает жир до остаточной массовой доли 2,7 (снижение концентрации жира в 3,7 раз) в течение 7 суток. Тогда как в контроле, за то же время, жир разлагается до концентрации 4,8. Также было проведено определение КОЕ/мл в зависимости от времени культивирования. Титр клеток штамма .23 снижается в зависимости от времени культивирования от 1,5107 до 2,0103. Тем не менее, максимальное разложение жира, как показали проведенные эксперименты, происходит на третьи сутки. Штамм .23 был депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов с целью гарантийного хранения и патентной процедуры под номером - 0286. Анализ проведенных исследований позволил определить перспективность использования штамма рекомендовать в качестве основы биопрепарата для локальной очистки жиросодержащих вод. Этот штамм, как показал комплекс проведенных работ,обладает высоким уровнем липолитической и окислительной активности, и может эффективно разлагать жиры растительного и животного происхождения, содержащиеся в сточных водах. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм 23,депонированный РГП Республиканская коллекция микроорганизмов, под регистрационным номером- 0286, предназначенный для биодеструкции жиров.