Способ идентификации сортов и линий регенерантов яровой мягкой пшеницы с использованием молекулярно-генетических маркеров

(51) 12 15/05 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ паспортизации сортов и сомаклональных линий яровой мягкой пшеницы на основе молекулярногенетических формул,выявляющих идентификационные локусы ДНК с использованием- и -методов анализа полиморфизма. При решения технической задачи определены оптимальные условия получения стерильных проростков сортов и линий регенерантов пшеницы,оптимизированы протокола экстракции геномной ДНК сортов и линий регенерантов пшеницы, отработаны оптимальные условия амплификации ДНК пшеницы с и/или-праймерами,электрофоретического разделения продуктов амплификации и регистрации их длины в соотвествии с маркером, разработаны идентификационные формулы, отражающих генетическую оригинальность сортов и линий регенерантов мягкой пшеницы. Использование данного способа позволяет идентифицировать генетическую оригинальность сортов и линий регенерантов мягкой пшеницы. Данный способ может быть использован для выявления генетической оригинальности линий регенерантов, полученных биотехнологическими методами, а также в селекции и семеноводстве яровой мягкой пшеницы.(72) Хапилина Оксана Николаевна Новаковская Анна Петровна Райзер Олеся Борисовна Шек Галина Оразтаевна Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СОРТОВ И ЛИНИЙ РЕГЕНЕРАНТОВ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и молекулярной биологии представляет собой новый способ для идентификации сортов, гибридов и сомаклональных линий яровой мягкой пшеницы с использованием метода полимеразной цепной реакции и -, маркеров. Технической задачей изобретения являлось разработка способа молекулярно-генетической Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой новый способ идентификации сортов, гибридов и сомаклональных линий яровой мягкой пшеницы с использованием метода полимеразной цепной реакции и -, маркеров. Изобретение может быть использовано в селекции и семеноводстве яровой мягкой пшеницы. Яровая мягкая пшеница является стратегической культурой для Казахстана. В связи с возрастающим ростом сортового ассортимента пшеницы, а также коммерциализацией аграрного сектора в настоящее время все более актуальной задачей становиться ДНК-идентификация и паспортизация видов и сортов этой культуры. ДНК-технологии сегодня широко используются для оценки внутривидового разнообразия растений,позволяют идентифицировать сорта, виды растений,помогают закрепить авторские права селекционеров,позволяют изучать филогенетические взаимоотношения, используются для анализа эволюционных связей между различными таксонами. Многие методы ДНКанализа являются высокоинформативными, хорошо воспроизводятся, надежны при установлении индивидуальных особенностей генотипа. Возможность идентификации отдельных генотипов растений также весьма актуальна с позиций защиты природных экосистем и популяций от интрогрессии генетического материала из генетически модифицированных сортов. Еще одним из важных приложений генотип- специфичных маркеров является оценка сортовой эрозии, то есть обеднения генетических ресурсов той или иной культуры в связи с использованием в селекции ограниченного набора генотипов, что может привести к существенным экономическим потерям урожая в неблагоприятные годы. Идентификация сортов, линий и гибридов пшеницы является неотъемлемым элементом селекции и семеноводства этой важнейшей культуры. Методы идентификации сортов сельскохозяйственных растений базируются в основном на оценке морфологических признаков и биохимических (белковых) маркеров, которые не всегда являются достаточно точными. В то же время методы, основанные на использовании ДНКмаркеров, имеют ряд преимуществ, к числу которых можно отнести то, что они дают высоко воспроизводимые результаты и незаменимы в спорных случаях, когда применение традиционных подходов не позволяет достоверно различить исследуемые образцы. Важным моментом является также то, что при этом не требуются полевые испытания материала. Для выявления и изучения полиморфизма ДНК культурных растений, выявления внутривидовых и межсортовых широкое применение во многих лабораториях мира используется полимеразная цепная реакция с различными типами праймеров. Особый класс ДНК-маркеров основан на использовании праймеров,имеющих множественную локализацию в геноме, например,2 праймеры,комплементарные повторяющимся последовательностям генома -(. Использование молекулярных маркеров,связанных с ретротранспозонами, расположенными по всему геному и имеющими довольно высокий уровень полиморфизма,позволяет проводить дифференциацию генотипов.-метод анализа основан на полимеразной цепной реакции между праймерами,комплементарными последовательностям и двух рядом расположенных(длинных концевых повторов) ретротранспозона. Метод имеет высокую надежность и воспроизводимость,причем выявляется множество полиморфных вариантов, что позволяет выявлять отличия между генотипами. Метод(. ) аналогичен ,однако наряду с праймерами к ретротранспозонам используются микросателлитные праймеры - двух-,трех- или четырехбазовые, например, , или . Ввиду того, что микросателлиты могут выявить высокие показатели мутации,имеющие индивидуальное местоположение у различных генотипов. На фоне ежегодного увеличения количества возделываемых сортов пшеницы возрастает актуальность молекулярного маркирования сортов как отечественной, так зарубежной селекции, а также линий, полученных методами биотехнологии и генной инженерии. Выявленные с использованием методов и -методов анализа полиморфные области генома пшеницы позволяют идентифицировать сорта и сомаклональные варианты яровой мягкой пшеницы посредством выявления характерного для каждого генотипа набора маркеров, необходимого для паспортизации. Аналог изобретения. Нами не найдено способа идентификации сортов и сомаклональных вариантов пшеницы с использованием молекулярно генетических маркеров. Из аналогичных изобретений можно отметить патент на способ идентификации сортов сои на основе микросателлитныхмаркеров (Антонова Т.С.,Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Челюстникова Т.А. Способ идентификации сортов сои на основе микросателлитныхмаркеров // РФ, А с. 2388828, МПК 12 1/68, А 01 Н 1/04, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур имени Пустовойта Российской академии сельскохозяйственных наук з. 28.10.2008, публ. 10.05.2010). Недостатком данного способа идентификации сортов является низкий уровень внутрисортового полиморфизма, а также слабая информативность микросателлитных маркеров для выявления индивидуальных отличий сомаклональных линий пшеницы. Отличие предлагаемого нами способа идентификации от аналога заключается в использовании вместо микросателлитных (-) маркеров, молекулярно-генетических маркеров, 26271 визуализация результатов амплификации в ультрафиолетовом свете с использованием гельдокументирующей системы-,регистрация длин амплификатов в соответствии с используемым маркером, буквенное кодирование используемых маркеров,составление идентификационной формулы генотипа. Достижения технического результата позволят идентифицировать сорта и сомаклональные варианты яровой мягкой пшеницы, созданные методами биотехнологии,что повысит эффективность селекции этой стратегической культуры, а также закрепит авторские права селекционеров и биотехнологов. Пример 1. Отбор семян пшеницы, их стерилизация и получение стерильных проростков Для проведения молекулярно-генетической идентификации отбирали среднюю пробу семян в повторностях, кратным 10. Далее семена промывали в растворе детергента, после чего проводили 3-х кратную промывку в проточной водопроводной воде. Далее семена обрабатывали 10 гипохлоритом натрия в течение 20 минут с последующей промывкой стерильной дистиллированной водой. Это способствует удалению поверхностной микрофлоры,контаминирующей поверхность семян пшеницы. Затем стерильные семена пшеницы раскладывали отдельно для каждого генотипа в чашки Петри для проращивания. Период проращивания зависит от генетических особенностей сорта и составляет в среднем 3-5 дней. Затем у проростков каждого генотипа в отдельности стерильным скальпелем отделяли проростки длиной 2-4 см, которые помещали в центрифужные пробирки фирмы Эппендорф. Пример 2. Выделение ДНК отдельно для каждого генотипа с использованием стандартных методов Для выделения ДНК из стерильных проростков яровой мягкой пшеницы использовали классические методы выделения ДНК с использованием СТАВ- и-буферов. Основным отличием этих двух методов является состав экстрагирующих буферов(таблица 1). Таблица 1 Оптимизированные протокола выделения ДНК из проростков пшеницы комплементарных последовательностям ретротранспозонов - - и - маркеров,данный способ предлагается для использования при составлении генетических паспортов сортов и сомаклональных линий пшеницы. Ретротранспозоны рассеянны по геному неравномерно и демонстрируют большую скорость молекулярной эволюции, чем конститутивные элементы генома. Поскольку ретротранспозоны являются высокополиморфными локусами, они могут быть использованы для выявления генетических различий между формами одного вида, что чрезвычайно расширяет возможности направленной селекции растений. Возможность идентификации значительного количества локусов,высокая информативность и стабильность результатов делают этот метод наиболее предпочтительным для идентификации и паспортизации сортов, линий и гибридов растений. Преимущество данного способа состоит в повышении уровня идентификации сортов и линий регенерантов пшеницы посредством увеличения числа исследуемых локусов ретротранспозонов, а также в повышении эффективности способа идентификации генотипов посредством фингерпринтинга продуктов амплификации. Задача изобретения - разработать способ молекулярно-генетической паспортизации сортов и сомаклональных линий яровой мягкой пшеницы на основе молекулярно-генетических формул,выявляющих идентификационные локусы ДНК с использованием - и -методов анализа полиморфизма. Технический результат, который может быть достигнут с использованием данного способа идентификации определение генетической оригинальности сортов и сомаклональных линий яровой мягкой пшеницы посредством совокупности операций отбор семян пшеницы, их стерилизация и получение стерильных проростков, выделение ДНК отдельно для каждого генотипа с использованием стандартных методов, амплификация ДНК каждого генотипа с - и/или -праймерами,разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в агарозном геле, Этап выделения Экстр акция ДНК Гомогенизация в - буфере (200 Г омогенизация и инкубация в СТАВ( 8,5), 250, 25, 0,5 буфере (2 М , 5 М , 0,5 М ,) - 5 мин. 5 СТАВ) при 65 С в течение 1 ч. Выдел ение/осажде Осаждение натрий- тригидрата-цетатом при Осаждение смесью хлороформние ДНК- 20 С в течение 10 мин, центрифугированиеизопропанол (241) при комнатной при 13 000 об/мин в течение 5 мин. Осаждениетемпературе в течение 1 ч,и очистка изопропанолом,центрифугирование при 3 000 об/мин в центрифугирование при 13 000 об/мин втечение 5 мин, отбор интерфазы. течение 10 мин, удаление супернатанта.Осаждение ДНК изопропанолом из Высушивание осадка при комнатнойрасчета 2/3 к объему при комнатной температуре в течении 40-60 минут, затемтемпературе 10-12 часов,растворение его в деионизированной воде. центрифугирование при 12000 об/мин в течение 10 мин, удаление супернатанта. 3 СТАВ-метод Высушивание осадка при комнатной температуре в течении 40-60 минут,затем растворение его в деионизированной воде. Визуализация экстрагированной ДНК проводили с использованием гельдокументирующей системы- в УФ-свете, для чего осуществляли электрофорез в 1-ном агарозном геле. В каждую лунку агарозного геля вносили смесь, состоящую из 4 мкл бромфенолового синего и 7 мкл образца ДНК отдельно каждого генотипа. Г ель помещали в камеру с ТЕ-буфером. Электрофорез проводили при 299 и 90 в течение 30 минут (фиг. 1). Определение количества выделенной ДНК, а также соотношение А 260/А 280 проводили с использованием биофотометра -. Количество экстрагированной СТАВ-методом ДНК варьирует от 335,0 до 3582,2 /, в среднем,на 1 образец - 279,79 /. Количество ДНК,экстрагированной с использованием -метода,варьирует от 187,7 до 2457 /, что также достаточно для проведения дальнейших молекулярногенетических исследований. Пример 3. Амплификация ДНК пшеницы с- и/или - праймерами Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе фирмы-. Амплификацию проводили на концевых повторах ретротранспозона семейства 173 (-элемента 173), для этого использовали ПЦР-смесь следующего состава ДНК 25 нгНС 1 - 20(4)24 0,5 н праймеров 200 (н , 1 е.а. полимеразы. Режим амплификации следующий 94 С - 2 мин 2) 94 С - 40 с 45/55 С - 40 с 72 С - 5 мин. Общее количество циклов 35. Последовательность используемых праймеров следующая 5 -6 -11-анализа амплификацию проводили в комбинации с микросателлитными праймерами 17 - 10- 10) и 6 - 100. Условия амплификации были аналогичны предыдущим. Температура отжига составляла д ля 6 и 5-45 С,11 и 16-55 С. Время амплификации - 1,5 часа. Программа амплификации состояла из нескольких циклов. Первые две минуты происходил нагрев до 94 С, затем 35 циклов по 40 секунд при 94 С, 40 секунд при 45-55 С, в зависимости от типа праймера, затем 5 минут при 72 С. Продукты амплификации разделяли на фракции методом электрофореза в 2 агарозном геле, в ТВЕ 4 буфере. Электрофоретическое разделение амплификатов проводили в камере для горизонтального электрофореза в течение 2,5-3 ч при силе тока 299 мА. Визуализацию проводили в ультрафиолетовом свете с помощью гельдокументирующей системы. Регистрацию длин фрагментов в каждом отдельном спектре проводили в соответствии с ДНК-маркером молекулярного веса (1 ) производства диген. По результатам амплификации с праймерамибыли выявлены характерные фрагменты,позволяющие идентифицировать отличия линий регенерантов друг от друга и от исходных форм(фиг. 2). Исследуемые генотипы отличались друг от друга в основном по низкомолекулярным бэндам, в то время как имели 3 общих, характерных для всех генотипов пшеницы бэнда длиной 300, 550 и 1000 п.о. Данный тип молекулярных маркеров позволяет выявлять индивидуальность линий регенерантов мягкой пшеницы,полученных биотехнологическими методами,на уровне умеренно повторяющихся последовательностей. Использование в качестве праймеров к длинным концевым последовательностям ретротранспозоновв комбинации с микросателлитными праймерами также позволяет получать относительно простые, хорошо воспроизводимые спектры продуктов амплификации,удобные для идентификации генотипов пшеницы, полученных с использованием различных схем селекции. Пример 4. Составление идентификационной формулы генотипа На основе анализа спектров амплификации с использованием - и - методов анализа была проведена регистрация исследованных генотипов пшеницы каждой линии соответствует формула, характеризующая специфичность данного генотипа. Каждой паре праймеров, используемых для микросателлитного анализа был присвоен идентификациооный код в виде буквы А -5 В -6 С -11-16 Е -17 Н-МС 1 К -5 МС 6-517-6-66-1717. После чего была проведена разработка формул, позволяющих оценить генетическую структуру линий регенерантов. Нижний индекс в формуле означает размер фрагмента,амплифицированного с конкретным праймером. Таблица 2 Молекулярно-генетические формулы генотипов яровой мягкой пшеницы Линия Идентификационная формула 118/95-1 2002504005002004008001000100600900 118/95-1 с МС 0,3 В 200 В 280 В 350 В 450 В 6 О 0 В 900 В 150020025040050040080010004001706-1-1./ Пир 28 21 150300385500300200250400500400 118/94-1 с МС 10 А.а 3005002002504001001801- 7-1 118/94-1 с МС 10 А.а 20025040050020040080010001001- 9-3 118/94-1 с МС 10 А.а 200250400500700400 181 Генетический паспорт, предложенный в виде формулы, содержит полную информацию о идентификационных маркерах, их размерах и код праймера. При проведении идентификации с использованием 11 молекулярно-генетических маркеров было исследовано 57 сортов и линий регенерантов мягкой пшеницы. Сочетание полиморфных фрагментов ДНК не совпадают ни у одной из изученных линий регенерантов и отличаются от исходных форм. Были выявлены оптимальные комбинации праймеров, выявляющие наибольший процент полиморфизма - праймер 5, праймер 6 и 517. Для проведения идентификации сортов и линий регенерантов мягкой пшеницы предлагается использовать и/или-анализ,поскольку данные молекулярно-генетические маркеры охватывают большую (до 70) часть генома,кроме того,являются высокоинформативными и обладают высокой разрешающей способностью. Предлагаемый способ идентификации генотипов пшеницы отличается относительной простотой выполнения и высокой воспроизводимостью. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ идентификации сортов и линий регенерантов яровой мягкой пшеницы с использованием молекулярно-генетических маркеров, включающий отбор семян пшеницы, их стерилизацию и получение стерильных проростков,выделение ДНК отдельно для каждого генотипа,амплификации ДНК каждого генотипа с праймерами, разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в агарозном геле, визуализацию результатов амплификации в ультрафиолетовом свете,регистрацию длин амплификатов в соответствии с используемым маркером, буквенное кодирование используемых маркеров,составление идентификационной формулы генотипа, отличающийся тем, что амплификацию ДНК проводят с использованием