Способ получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засолению

(51) 12 5/04 (2011.01) 01 4/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы,устойчивых к засолению. Задача изобретения - получение морфогенных каллусов яровой мягкой пшеницы на селективных средах с добавлением хлорида натрия с последующей регенерацией растений-регенерантов и получение семенного потомствав культуре. Технический результат, может быть достигнут при использовании устойчивых каллусных линий яровой мягкой пшеницы к хлориду натрия(концентрации 0,3 0,5 и 0,75) для получения из них растений-регенерантов. Достижения технического результата позволят получать в условияхрастения-регенеранты,устойчивые к хлориду натрия, что позволит значительно увеличить разнообразие форм яровой мягкой пшеницы и повысить эффективность селекционных программ,направленных на повышение солеевыносливости этой культуры.(72) Шек Галина Оразтаева Орозалиева Жылдыз Батыркановна Ергалиева Алия Женисовна Новаковская Анна Петровна Каримова Венера Конысбаевна Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙРЕГЕНЕРАНТОВ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой новый способ получения 25752 Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой новый способ получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засолению. Пшеница является важнейшей стратегической культурой мира, возделываемой на общей площади около 200 млн. га при общем мировом производстве 600 млн. т зерна в год. На сегодняшний день огромное количество площадей в мире характеризуется повышенными концентрациями солей. Ежегодно увеличиваются площади засоленных земель из-за искусственного орошения и прочих природных изменений. В Казахстане количество земель с комплексами солонцов составляет 3,3 млн. га (около 30 всех пахотных земель), в основном преобладает хлоридное засоление. В связи с увеличением с каждым годом засоленных земель приходится возделывать сельскохозяйственные растения, такие как пшеница на этих землях. Создание сортов пшеницы, устойчивых к засолению является весьма актуальным. В настоящее время методами клеточной селекции можно создать ценные формы растений пшеницы,устойчивые к засолению. Известно,что устойчивость к солям является генетическим признаком, имеющим полигенный характер, в связи с этим в процессе селекции можно вызвать экспрессию генов, повышающих устойчивость растений к засолению. Аналог изобретения. В данном направлении нами не найдено идентичного способа получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы,устойчивых к засолению. Из аналогичных изобретений можно отметить способ получения растений-регенерантов,включающий посадку экспланта на питательную среду для инициации каллуса и закладки меристематических зон, получение проростков при пересадке меристематических зон на питательную среду для формирования регенерантов. Подращивание и укоренение растений на питательной среде до высадки их в грунт,отличающихся тем, что в питательные среды для инициации каллуса и формирования регенерантов дополнительно вводят ацетон в количестве 1000020000 мг/л (Внучкова В.А., Аш О.А. Способ получения растений-регенерантов// Патент Российской Федерации 2027757, класс патента 12 5/04, А 01 Н 4/00, номер заявки 5039812/13,подача заявки 24.04.1992, дата публикации 27.01.1995). Также известен способ получения наследственно измененных форм пшеницы, сущность которого заключается в культивировании эксплантов на каллусогенной среде в первом пассаже в присутствии фитогормонов ауксинового ряда,получение эмбриогенного каллуса,культивировании его во втором и последующих пассажах на каллусогенной среде, затем его пересадка на среду для регенерации растений,получение регенерантов, доращивании растенийрегенерантов до семенного потомства. Затем отбор 2 среди этого потомства сомаклональных измененных форм, отличающихся тем, что в каллусогенной среде второго и последующих пассажей используют сниженный химический потенциал воды до таких величин,при которых последующее культивирование каллусов вызывает появление первых признаков некроза в виде начальной стадии высыхания и побурения при сохранении избирательной способности каллусов растений(Тучин СВ., Итальянская Ю.В. Способ получения,наследственно измененный форм пшеницы // Патен Российской Федерации 2095971, класс патента А 01 Н 4/00, А 01 Н 1/04, номер заявки 95112871/13,подача заявки 20.07.1995, дата публикации 20.11.1997). Отличие предлагаемого способа заключается в получении растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы методом селекции,с использованием селективного агента хлорида натрия в следующих концентрациях 0,3 0,5 0,75 в индукционной среде Мурасиге и Скуга (МС) с последующей регенерацией морфогенных каллусов на среде для регенерации. Задача изобретения - получение морфогенных каллусов яровой мягкой пшеницы на селективных средах с добавлением хлорида натрия с последующей регенерацией растений-регенерантов и получение семенного потомства , в культуре. Технический результат может быть достигнут при использовании устойчивых каллусных линий яровой мягкой пшеницы к хлориду натрия(концентрации 0,3 0,5) и 0,75) для получения из них растений-регенерантов. Достижения технического результата позволят получать в условияхрастения-регенеранты,устойчивые к хлориду натрия, что позволит значительно увеличить разнообразие форм и повысить эффективность селекционных программ,направленных на повышение солеевыносливости этой культуры. Пример 1 . Подбор оптимальных концентраций хлорида натрия для получения устойчивых каллусных линий яровой мягкой пшеницы к засолению. Для проведения клеточной селекции яровой мягкой пшеницы на устойчивость к засолению провели эксперимент по получению каллусных линий, устойчивых к хлориду натрия. В качестве объекта исследований использовали гибрид яровой мягкой пшеницы 1 24/05. Для подбора оптимальных концентраций хлорида натрия в питательной среде использовали следующие концентрации МС (контроль) 0,30,50,751,0 . Для проведения клеточной селекции яровой мягкой пшеницы на устойчивость к засолению использовались методы одноступенчатого отбора. Оценку вели по приросту биомассы каллусов, по выживаемости в селективных условиях. Через 21 дней культивирования на селективной среде анализировали прирост биомассы и размеров каллусов. На предлагаемой селективной среде для 25752 индукции каллусогенеза образуется несколько видов каллусов на среде МС (контроль) каллус был плотный с беловатой бархатистой поверхностью,морфогенный,рыхлый,глобулярный,отличающийся высокой скоростью роста. По результатам исследований изучаемый генотип отличался по реакции к действию токсичных действий хлорида натрия, прежде всего в накоплении биомассы. Максимальный прирост биомассы был в контрольном варианте. Удельный прирост на контрольном варианте был 47,1, при добавлении к среде культивирования 0,3 и 0,5 хлорида натрия прирост каллусной массы снизился почти вдвое, морфогенез и регенерация были удовлетворительными для получения фертильного потомства (таблица 1). Таблица 1 Влияние концетрация хлорида натрия на прирост биомассы каллусов яровой мягкой пшеницы (2011 г.) Гибрид Схема селекции Масса каллусов, мг Прирост биомассы Масса Масса мг каллусов до каллусов после пассажа пассажа 124/05 М (контроль) 532,6 783,9 25 47,1 0,3512,5 643,2 13 25,4 0,5492,4 402,5 Дальнейшее снижение биомассы наблюдали при увеличении концентрации хлорида натрия в среде культивирования. В результате модельного опыта методически определены оптимальные концентрации селективного агента - хлорида натрия в процессе клеточного отбора и максимального выхода, фертильных регенерантов - 0,3-0,5 хлорида натрия в индукционной среде МС. Концентрация 1,0 была летальной. Визуально можно увидеть различия каллусов на различных вариантах опыта на фиг. 1. Пример 2. Определение содержания общего белка в каллусных линиях яровой мягкой пшеницы. Для изучения ответной реакции зрелых зародышей гибрида 1 24/05 при культивировании на различных концентрациях хлорида натрия нами было проведено определение содержания общего белка в каллусных тканях яровой мягкой пшеницы. Содержание общего белка в каллусах яровой мягкой пшеницы определяли спектрофотометрическим методом по Бредфорду. Навеску 190 мг каллусных тканей яровой мягкой пшеницы растирали в дистиллированной воде до однородной массы и после этого фильтровали через фильтровальную бумагу. В лунку ввели по 100 мкл 1(фосфорно-солевой буфер), затем внесли исследуемый отфильтрованный материал и 100 мкл реактива Бредфорда. После определяли интенсивность окрашивания спектрофотометром при длине волны 490 нм. Для определения общего растворимого белка использовали каллусные ткани гибрида 1 24/05 в следующих концентрациях 0 (контроль) 0,3 0,5 0,75 1,0 (таблица 2). Таблица 2 Определение содержания общего белка в каллусных тканях яровой мягкой пшеницы Гибриды Схема селекции Содержание белка в каллусных тканях, мкг/мл 1 24/05 М (контроль) 100030 0,350015 0,550015 0,751253,7 11253,7 В результате исследований содержание растворимого белка в каллусных тканях,полученных на среде МС, составило 1000 мкг/мл. Повышения концентрации хлорида натрия (более 0,3 ) понижает содержание растворимого белка до 500 мкг/мл. При концентрации хлорида натрия 0,5 содержание растворимого белка составило 500 мкг/мл. Снижение растворимого белка наблюдали при концентрации 0,75125 мкл/мл, 1- 125 мкл/мл. Это связано с тем, что выше концентрации 0,75 хлорида натрия трудно получить устойчивые каллусные линии к засолению. Оптимальными концентрациями для получения устойчивых каллусных линий являются 0,3 и 0,5 . При этих концентрациях содержание белка выше по сравнению с другими вариантами. Видимо это связано стем, что каллусные клетки включают свой защитный механизм к стрессовым условиям, что согласуется с литературными данными. Визуально определяли количество общего растворимого белка в каллусных тканях яровой мягкой пшеницы (фиг.2). Пример 3. Характеристика морфогенетической и регенерационной способности каллусных тканей на селективных средах В исследованиях важно было определить регенерационную способность каллусов,культивируемых на селективных средах полученных на различных концентрациях хлорида натрия. Получение растений-регенерантов является 3 25752 наиболее трудной задачей,способность соматических клеток растений к регенерации целого растения является основой использования культуры клеток. Культивирование каллусных линий на средах,содержащих хлорид натрия в различной концентрации, значительно снижает способность к регенерации. Даже однократное воздействие селективной среды приводит к резкому снижению их регенерационной способности. Для пассирования на среду для регенерации использовали выжившие каллусы, без признаков и почернения, сохранившие свою глобулярную структуру. В качестве среды для регенерации использовали среду Мурасиге-Скуга. Изменение гормонального фона после периода индукции каллусогенеза с введением в среду кинетина индолилуксусной кислоты в соотношении 11 способствует формированию побегов и корней. Культивирование на среде для регенерации осуществляли в течение 45 дней. В течение этого времени в клетках каллусных культур под влиянием фитогормонов- ауксинов и цитокининов происходит дифференциация клеток с формированием зачатков органов целого растения. Одной из сложностей получения регенерантовпосле культивирования тканей на селективных средах является то, что концентрация хлорида натрия изменяет гормональный статус клеток, что приводит к повышенному проявлению ризогенеза в каллусных тканях и затрудняет процессы образования стеблей и листьев. Большая часть каллусов погибает в процессе культивирования на селективных средах. Часто каллусы меняют цвет темнеют, приобретают желтый оттенок, иногда происходит изменение структуры каллусных тканей. Каллусы обводняются,становится водянистыми, теряют свою глобулярную структуру,характерную для морфогенных каллусов. Нами на среде для регенерации было зафиксировано несколько типов каллусов, сформированных после культивирования на средах с 0,3 и 0,5(таблица 3). Таблица 3 Формирования каллусных линий яровой мягкой пшеницы для получения пробирочных растений Схема селекции Колич-во Выжившие Количество каллусов на среде для регенерации,Морфоген Каллусы,ГемоРизоРизоГем-МогеНеморКаллусов, енез генез незом фогенШт ные М (контроль) 42 93,3 8,9 43,7 5,2 35,5 0,352 86,6 11,4 38,1 4,9 32,2 0,543 71,6 10,1 35,0 2,7 47,8 0,758 29,6 14,5 7,5 1 Количество выживших каллусов в зависимости от концентрации хлорида натрия варьирует в пределах от 29,6 до 93,3. Среди выживших в процессе отбора каллусов имелись такие, которые утратили способности к органогенезу, так называемые неморфогенные каллусы, варьирующие от 7,5 до 47,8. Такие каллусы имели вид рыхлый,слизистый, желтого цвета и несколько обводненной массы недифференцированных клеток. Из таких каллусов в виду их консистенции, слабого межклеточного взаимодействия, регенерировать целое растение невозможно. Процент каллусов дифференцирующихся по типу гемморизогенеза и способных сформировать целое растение,варьировало в интервале от 8,9 до 10,1 в зависимости от концентрации хлорида натрия. В зависимости от увеличения концентрации хлорида натрия на варианте МС 0,75 отсутствовали каллусы, дифференцирующие по типу геммогенеза и гемморизогенеза. Наибольшее количество были представлены каллусы, дифференцирующиеся по типу ризогенеза с рыхлыми глобулярными каллусными секторами. На варианте МС 1,0 каллусы недифференцированы. В дальнейшем растения-регенеранты с хорошо сформированными корнями и стеблями высаживали в почву под пленочные укрытия. В процессе адаптации к не стерильным условиям растениярегенеранты испытывают сильный стресс, часть их гибнет на стадии укоренения. Полученные растения выращивались в почвогрунте в условиях тепличной комнаты, полив проводили вручную по мере высыхания почвы и выращивали до полного созревания семян (фиг.3). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения растений-регенерантов яровой мягкой пшеницы, устойчивых к засолению, из каллусных линий, полученных при концентрациях хлорида натрия, равных 0,3 0,5 0,75 .