Способ получения растений-регенерантов пшеницы, устойчивых к септориозу

(51) 01 4/00 (2011.01) 12 5/04 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технической задачей изобретения являлось получение растений-регенерантов пшеницы,устойчивых к септориозу. При решении технической задачи проведено выделение изолятов грибов из пораженных участков пшеницы, получен культуральный фильтрат фитопатогенного гриба, индукцирована первичная каллусная ткань яровой мягкой пшеницы на селективной среде содержащей 20-30 культурального фильтрата гриба .,получены растения-регенеранты на среде для индукции органогенеза,проведена оценка устойчивости растений-регенерантов бензимидазольным методом. Использование данного способа позволяет получать растениярегенеранты пшеницы, устойчивые к септориозу. Данный способ может быть использован в биотехнологических работах для получения растений-регенерантов пшеницы, при проведении клеточной селекции и для размножения ценных каллусных линий,полученных методами биотехнологии.(72) Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Койшибаев Мурат Койшибаевич Райзер Олеся Борисовна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Созинова Любовь Феодосьевна Тагиманова Дамеля Сеитовна Хапилина Оксана Николаевна Шек Галина Оразтаевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙРЕГЕНЕРАНТОВ ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВЫХ К СЕПТОРИОЗУ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой новый способ получения растений-регенерантов пшеницы, устойчивых к септориозу. Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой новый способ получения растений-регенерантов пшеницы. Септориоз - одна из наиболее вредоносных болезней пшеницы, возбудителем которой является гриб. Гриб поражает все надземные органы растения. На листьях и влагалищах образует многочисленные мелкие,продолговатые, в виде штрихов или темно-бурые с хлоротичным окаймлением пятна. Болезнь может переходить на зерно, которое не имеет видимых симптомов поражения и отличается от здорового легковесностью и щуплостью. Возбудитель сохраняется на растительных остатках, всходах и семенах в виде пикнид и мицелия. Конидии и аскоспоры являются источником первичного заражения всходов пшеницы. В течение вегетации распространение возбудителя происходит с помощью конидий. Поражаемость растений пшеницы возбудителями болезней является одной из главных причин снижения урожайности и качества зерна пшеницы, а надежная защита растений от болезней и вредителей является одним из залогов высоких устойчивых урожаев зерна. Для успешного использования данной культуры в сельскохозяйственном производстве необходимо иметь высокопродуктивные сорта с высокими адаптационными свойствами,устойчивые к неблагоприятным факторам среды. Традиционными методами селекции сложно получить устойчивые к септориозу формы пшеницы, так как признак устойчивости носит полигенный характер. В связи с этим разработка и усовершенствование биотехнологических и селекционных методов,позволяющих получать растения-регенеранты,устойчивые к грибу ., является одной из актуальных задач сельскохозяйственной биотехнологии. Аналог изобретения. В данном направлении нами не найдено способа получения растенийрегенерантов пшеницы, устойчивых к септориозу. Из аналогичных изобретений можно отметить патент по способу получения растенийрегенерантов, включающий посадку экспланта на питательную среду для инициации каллуса и закладки меристематических зон,получение проростков при пересадке меристематических зон на питательную среду для формирования регенерантов, подращивание и укоренение растений на питательной среде до высадки их в грунт, отличающихся тем, что в питательные среды для инициации каллуса и формирования регенерантов дополнительно вводят ацетон в количестве 10000-20000 мг/л. (Внучкова В.А., Аш О.А. Способ получения растенийрегенерантов. Патент Российской Федерации 2027757, класс патента 125/04,А 01 Н 4/00, заявитель - Научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии,номер заявки 5039812/13, дата подачи заявки 24.04.1992, дата публикации 27.01.1995). Так же имеется патент по способу получения наследственно измененных форм пшеницы,сущность которого заключается в культивировании эксплантов исходных растений на каллусогенной среде в первом пассаже в присутствии фитогормонов ауксинового ряда, получении эмбриогенного каллуса, культивировании его во втором и последующих пассажах на каллусогенной среде, затем его пересадке на среду для регенерации растений, поггучение регенерантов, доращивании растений-регенерантов до семенного потомства,отборе среди этого потомства сомаклональных измененных форм, отличающихся тем, что в каллусогенной среде второго и последующих пассажей используют снижение химического потенциала воды до таких величин, при которых последующее культивирование каллусов вызывает появление первых признаков некроза в виде начальной стадии высыхания и побурения при сохранении избирательной способности каллусов растений. (Тучин СВ., Итальянская Ю.В. Способ получения наследственно измененный форм пшеницы // Патен Российской Федерации 2095971, класс патента А 01 Н 4/00, АО 1 /04,заявитель - Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока Научнопроизводственного объединения Элита Поволжья,номер заявки 95112871/13, дата подач заявки 20.07.1995, дата публикации 20.11.1997). Отличие предлагаемого способа заключается в получении растений-регенерантов пшеницы методом селекции, устойчивых к септориозу с использованием культурального фильтрата фитопатогенного гриба .штамма 1/05, выделенного в лабораторных условиях из пораженной пшеницы на специализированную питательную среду. Задача изобретения - получить растениярегенеранты пшеницы, устойчивые к септориозу биотехнологическими методами. Технический результат, который может быть достигнут при использовании способа получения растений-регенерантов пшеницы, устойчивых к септориозу - это выделение изолятов грибов из пораженных участков пшеницы,получение культурального фильтрата фитопатогенного гриба,индукция первичной каллусной ткани мягкой пшеницы на селективной среде, содержащей 20-30 культурального фильтрата гриба .,пересадка морфогенного каллуса на среду для регенерации, оценка устойчивости растешйрегенрантов к септориозу. Достижения технического результата позволят получать методами селекции в условиях,растения-регенеранты, устойчивые к септориозу,что значительно повысит эффективность селекционных программ,направленных на повышение болезнеустойчивости этой культуры. Выделение изолятов грибов рода .проводили по методике Г.В. Пыжиковой и А.А. Саниной с соавторами (1989). Для этой цели использовали голодный агар (15 г агара на 1000 мл дистилированной воды) или картофельно 25208 декстрозный агар, а также малы-дрожжевой агар,приготовленный по схеме дрожжевой экстракт - 4 г,мальт-экстракт - 4 г, сахароза - 4 г, агар - 15 г,дистиллированная вода - 1000 мл. Первые двое суток гриб .инкубировали в термостате при температуре 25 С. Для .характерен более рыхлый,шерстистый, быстрорастущий от беловатого до розового цвета воздушный мицелий, в центре более уплотненный, иногда выпуклый. Субстратный мицелий светло-коричневый, по краям - беловатый,розовый до красно-карминового цвета. Рост интенсивный, диаметр через 12-15 суток достигал 50-70 мм (фиг. 1). Использовались два метода для получения культуральных фильтратов инокуляция жидкой органо-минеральной среды следующего состава картофель 200 г/л, сахароза 20 г/л, дрожжевой экстракт 12 г/л вегетативным мицелием и споровой суспензией. Культивировали в покое при температуре 25 С - в течение 21 дня (фиг. 2). Затем отфильтровывали культуральную жидкость через несколько видов фильтров капроновый, нейлоновый с диаметром пор 200 мкм,бумажный, автоклавировали при 120 С в течение 30 минут. Автоклавированный культуральный фильтрат хранили в холодильнике при 4 С и использовали для постановки клеточной селекции. Для получения первичной каллусной ткани в качестве эксплантов использовали зрелые и незрелые зародыши семян пшеницы. Предварительно семена обрабатывали в растворе детергента, после чего проводили пятикратную промывку проточной водой, в заключение трехкратную промывку в стерильной дистиллированной воде. Таким образом,достигается удаление патогенной микрофлоры,контаминирующей поверхность семян пшеницы. Для освобождения от внутренней инфекции семена обрабатывали 70 хлорамином в течение 10-15 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Зародыши вычленяли в асептических условиях и помещали в чашки Петри с агаризированной средой. Каллус выращивали в темноте при температуре 26 С и 70-ной относительной влажности воздуха. В качестве базовой среды использовали минеральную среду Мурасиге и Скуга (1962), с добавлением тиамина- 1,0 мг/л мезо-инозита 80 мг/л сахарозы - 3 агара - 0,7 2,4-Д - 2-3 мг/л. При использовании в клеточной селекции культурального фильтрата гриба .,наиболее оптимальными концентрациями являются 20-30 культурально фильтрата. Все работы по получению каллусной ткани проводятся в асептических условиях. Период культивирования на данном этапе составляет 21 день. Первичная каллусная ткань пшеницы образуется на раневых поверхностях эксплантов. Интенсивность роста первичного каллуса во многих случаях различная, в зависимости от генотипов пшеницы, но чаще всего через 7-10 дней визуально обнаруживаются новообразования. Практически все используемые экспланты,независимо от генотипа, обладают способностью к инициации каллусов (таблица 1). На предлагаемой селективной среде для индукции каллусогенеза образуется несколько видов каллусов - плотный, компактный, с беловатой бархатистой поверхностью, рыхлый, глобулярный,отличающийся высокой скоростью роста и рыхлые,обводненные структуры. Тип образующихся каллусов чаще зависит от количества культурального фильтрата фитопатогенного гриба вносимого в среду для проведения клеточной селекции. Таблица Влияние культурального фильтрата гриба .на прирост биомассы Генотип Целинная Зс образования пробирочных растений,их пересаживали для укоренения в пластиковые горшочки с перлитом, а затем в сосуды с 3 почвосмесью (фиг. 3). культивирование растенийрегенерантов проводили в условиях фактеростатной комнаты при температуре, длине светового дня 1416 ч., с освещенностью 7000 тыс. люкс. Оценку устойчивости растений-регенерантов к возбудителю септориоза проводили бензимидазольным методом. Суть его заключается в том, что водный 0,01-ый раствор бензимидазола слабой концентрации позволяет длительное время сохранять жизнеспособность отделенных от растения листьев (или их отрезков), помещенных в раствор. Для оценки устойчивости использовали поверхностно стерилизованных 1 раствором хлорамина отрезки листьев 10-дневных проростков пшеницы, которые помещали в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу. Поверхность листьев смачивали 0,01-ным раствором бензимидазола,после чего инокулировали кусочками спороносящего мицелия гриба. Период инкубации составил 5-7 дней, по истечении которого проводили визуальную оценку по степени поражения патогеном. Учитывали такие признаки, как образование некротических пятен,интенсивность их образования, наличие пожелтения листьев, а также внедрение гиф в поверхностные ткани листьев. При использовании бензимидазольного метода наблюдали резкое отличие растений-регенерантов пшеницы, полученных на селективных средах с культуральным фильтратом гриба .от исходных форм по степени поражения. На отрезках листьев исходных форм наблюдали на 2-3 сутки наличие слабых некротических штрихов,которые разрастались при увеличении периода инкубации патогена. На 4-5 сутки на листьях исходных форм отмечали значительные некрозы,округлые, эллипсоидальные, светло-коричневые пятна, с бурой или хлоротичной зоной вокруг. Пятна часто сливались, образуя широкие полосы,занимающие до 1/3 поверхности листьев, при этом наблюдали активный рост гриба. Пораженные листья вскоре усыхали. При микроскопическом анализе наблюдали внедрение мицелиальных гиф в межклеточное пространство листовой пластинки. Линии регенерантов практически не отличались друг от друга - все они поражались в слабой степени или же признаки поражения отсутствовали. На отрезках листьев линий регенерантов четких реакций на внедрение возбудителя желтой пятнистости не наблюдали (фиг. 4). Растения-регенеранты,показавшие устойчивость,передаются в селекционные питомники для дальнейшего изучения и размножения, восприимчивые растения подлежат выбраковке. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения растений-регенерантов пшеницы,устойчивых к септориозу,предусматривающий выделение изолятов грибов из пораженных участков пшеницы,получение культурального фильтрата фитопатогенного гриба на органо-минеральной среде, индукцию первичной каллусной ткани мягкой пшеницы на селективной среде,содержащей 20-30 культурального фильтрата гриба.,регенерацию на индукционной среде для органогенеза, оценку устойчивости растений-регенерантов к септориозу бензимидазольным методом.