Способ очистки и концентрирования вируса оспы верблюдов

(51) 12 7/00 (2010.01) 61 39/42 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА ОСПЫ ВЕРБЛЮДОВ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой способ очистки и концентрирования вируса оспы верблюдов из инфицированной культуры клеток ПЯ (почки ягннка), который пригоден для выделения ДНК и изучения физико-химических свойств вируса. Способ очистки и концентрирования вируса оспы верблюдов из вируссодержащей суспензии предусматривает выделение вируса из клеток,осветление суспензии с помощью низкоскоростного центрифугирования, преципитацию вируса ПЭГ-ом,с последующим ультрацентрифугированием через 45-ную сахарозу. Очищенный и концентрированный вирус пригоден для выделения ДНК и изучения его физико-химических свойств.(72) Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Алыбаев Санжар Досанович Ажибаева Дана Тынышбековна Шораева Камшат Абитхановна Строчков Виталий Михайлович Червякова Ольга Викторовна Зайцев Валентин Лукьянович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 25753 Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и представляет собой способ очистки и концентрирования вируса оспы верблюдов из культуральной суспензии. Известны широко используемые методы выделения вирусов из семейства поксвирусов в ветеринарной вирусологии, в которых используются полиэтиленгликоль, сахароза, сефадекс, а также сефароза. Для очистки поксвирусов были испытаны различные методы, такие как гель-фильтрация,ионообменная хроматография и ультрацентрифугирование. Прототип 1 -.. . .,// . . . (1987), 68,1021-1028. В работе.был использован биогель-75, позволяющий зедерживать низкомолекулярные примеси. При воспроизведении метода с использованием биогели нами установлено, что выход вируса варьируется в пределах 50-52, а степень очистки от примесей составляет 85-87. Таким образом, методы гель-фильтрации для очистки вируса оспы верблюдов оказались малоэффективными, они приводят к большим потерям вирусной активности. Прототип 2 -.// . - 1962.-.- 18. -.- 9-18. Этот метод отличается от нашего ультрацентрифугированием в градиенте плотности раствора сахарозы. При центрифугировании основная масса вируса локализуется над раствором сахарозы. Прототип 3 -.// , 1962,18, -. 294-301. Данный метод отличается тем, что конечный этап очистки проводят в градиенте плотности раствора хлорида цензия. Хлорид цезия добавляется на суспензию вируса плотностью 1,25 г/мл и центрифугируется в течение 16 часов при обороте 37 000 на роторе 39 или 30 000 на роторе 40 в центрифуге . Таким образом, нами разработан наиболее оптимальный способ получения очищенного и концентрированного вируса методом ультраценрифугирования через 45 сахарозную подушку для оспы верблюдов. В результате подобрана эффективная комбинированная схема очистки и концентрирования вируса оспы верблюдов, включающие этапы осаждения вируса оспы верблюдов из осветленной культуральной вируссодержащей жидкости ПЭГом с м.м. 6000. центрифугирования осадка вируса через слой 45 сахарозную подушку. Исследования показали, что в испытанных условиях центрифугирования вирус оспы верблюдов осаждается на дно пробирки через слой 45-ного раствора сахарозы. Потери вируса при использовании 45 сахарозной подушки были незначительны, выход вируса составляет не менее 99,9. Данная схема получения очищенного вируса оспы верблюдов существенно сокращает время и скорость крутящего момента, а при этом активность вируса не теряется. Задачей настоящего изобретения являлось получение очищенного и концентрированного вируса оспы верблюдов пригодного для выделения нативной ДНК и изучения его физико-химических свойств. Сущность предлагаемого способа заключается в очистке и концентрировании вируса оспы верблюдов из вируссодержащей суспензии,предусматривает выделение вируса из клеток,осветление суспензии с помощью низкоскоростного центрифугирования, преципитацию вируса ПЭГ-ом,с последующим ультрацентрифугированием через 45-ную сахарозу. Очистку и концентрирование вируса проводят следующим образом. В работе используется штамм М-96 вируса оспы верблюдов. Инфицированную вирусом оспы верблюдов культуру клеток ПЯ (почки ягннка) после замораживания-оттаивания осветляют низкоскоростным центрифугированием при 1080 в течение 30 мин, при 4 в рефрижераторной центрифуге типа 6- , -,США. Осадок ресуспендируют в небольшом количестве 0,05 М ФБР 7,4 и обрабатывают ультразвуком в течение 20 с, с интервалами между озвучиваниями, а затем центрифугируют 30 мин при 1080 при 4. Надосадки объединяют. В полученную надосадочную жидкость вносят ПЭГ с м.м. 6000 до конечной концентрации 6-8. Преципитацию вируса проводят при 4 в течение 6-8 часов. Осадок вируса отделяют центрифугированием при 1080 в течение 30 мин,ресуспендируют в 0,05 М ФБР,7,4 110 первоначального объема и центрифугируют через слой 45 сахарозы при 52 500(25 000-27 000 ) в течение 60 мин на ультрацентрифуге типа 65, США. Осадок очищенного вируса ресуспендируют в минимальном объеме 0,05 М ФБР,7,4. Данный способ получения очищенного вируса с высокой степенью чистоты от балластных белков позволяет выделять нативную ДНК вируса оспы верблюдов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ очистки и концентрирования вируса оспы из семейства посквирусов, включающий выделение из клеток, осветления низкоростным центрифугированием, отличающийся тем, что получают концентрированный и очищенный от балластных белков вирус оспы верблюдов с высокой степенью чистоты,при этом центрифугирование проводят при 1080 в течение 30 мин, при 4 и осаждают из осветленной культуральной вируссодержащей жидкости ПЭГом с 6000 м.м, а также центрифугируют осадок через 45 сахарозную подушку.