Тест-система для лабораторной диагностики гриппа В (Influenza virus B) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

(51) 61 39/145 (2011.01) 12 15/10 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)(57) Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к молекулярной диагностике вирусных инфекций, и касается лабораторной диагностики вируса гриппа В (В) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В тест-системе для лабораторной диагностики гриппа В основным является постановка полимеразной цепной реакции для выявления РНК вируса гриппа типа В с использованием специфических праймеров. Тест-система позволяет обнаруживать РНК вируса гриппа с довольно высокой степенью точности в короткие сроки и диагностировать данную инфекцию за 2 - 2,5 часа. Разработанная тест-система на основе ПЦР является специфичным и высокочувствительным при диагностике вируса гриппа типа В.(72) Батырбаева Багдат Алмахановна Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Хайруллин Берик Мухитович Строчков Виталий Михайлович Еспембетов Болат Аманбаевич Сансызбай Абылай Рысбайлы Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА В ( Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к молекулярной диагностике вирусных инфекций, и касается способа диагностики вируса гриппа В (В) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Известна тест-система для лабораторной диагностики гриппа А и В методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) Прототип 1. ПЦР продукт, образующийся в результате амплификации гена М составляет 444 п.о. Амплификацию проводят при температурновременном режиме денатурация при 94 - 30 сек,отжиг при 55 - 30 сек, элонгация при 72 - 30 сек в течение 50 циклов. (. , . , .. . .,,-// . . 2003. - . 41- . 3487-3493). Известен способ диагностики вируса гриппа типа В с помощью метода полимеразной цепной реакции(ПЦР) Прототип 2 ПЦР продукт, образующийся в результате амплификации гена М составляет 241 п.о. (пар оснований). Амплификацию проводят при температурно-временном режиме денатурация при 92 - 1 мин, отжиг при 50 - 2 мин, элонгация при 74 - 2 мин в течение 40 циклов. ( , , ., .. . . 1992.-.-39.-. 1-13). Недостатком данных прототипов является то, что длительный временной режим значительно увеличивает время проведения исследований у прототипа 1 денатурация - 30 сек, отжиг - 30 сек,элонгация - 30 сек в течение 50 циклов и у прототипа 2 денатурация - 1 мин, отжиг- 2 мин,элонгация - 2 мин в течение 40 циклов. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка тестсистемы для лабораторной диагностики гриппа В(В) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), применяемую для выявления РНК вируса гриппа типа В из клинического материала(мазки, мокрота и фрагменты пораженной части легких). Задачей настоящего изобретения являлось разработка тест-системы для лабораторной диагностики гриппа В (В) методом ПЦР. Сущность изобретения заключается в разработке высокочувствительной и эффективной тестсистемы для лабораторной диагностики вируса гриппа типа В на основе полимеразной цепной реакции. Диагностика вируса гриппа типа В высокочувствительной и специфичной тест-системой на основе полимеразной цепной реакцией позволяет точно и очень быстро (2-2,5 часа) выявлять РНК вируса гриппа В из клинического материала. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Предлагаемая тест-система для лабораторной диагностики предусматривает выделение вирусной РНК, синтез кДНК, синтез праймеров, постановку ПЦР, проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных элек-трофореграмм. Проведение лабораторной диагностики вируса гриппа В тест-системой на основе ПЦР Необходимые материалы 1. Раствор 1 (состав 3,8 г гуанидин гидрохлорида, 0,5 мл твин 20, 3 мл 1 и 225 мг хлорида натрия. Конечный объем раствора довести до 20 мл очищенной водой) 2. Раствор 2 (состав 3,8 г гуанидин гидрохлорида, 3 мл 1 и 225 мг хлорида натрия. Конечный объем раствора довести до 20 мл очищенной водой) 3. Раствор 3 (состав 100 мл промывного раствора (1,12 г хлористого натрия, 2 мл 1 М трис,8,0 объем раствора доводят до 100 мл) и 240 мл 96 этанола) 4. РНК-элюент 5. Буфер для обратной транскрипции (состав 25 мл 1 М Трис-,8,4, 25 мл 1 М КС 1, 10 мл 0,5 М 2 и 10 мл 0,5 М ДТТ, конечный объем буфера доводят водой до 100 мл) 6. Обратная транскриптаза 7. /Д полимераза 8. ПЦР-буфер (состав 10 мл 1 М Трис-,8,4, 50 мл 1 М КС и 3 мл 0,5 М 2 объем буферной смеси доводят до 100 мл) 9. Деонизированная вода 10. Этанол (96-100) 11. Микроцентрифуга (регулируемая до 13000 оборотов в минуту) 12. Регулируемые пипетки 13. Стерильные наконечники для пипеток 14. Вортекс 15. Пробирки для микроцентрифугирования (0.2,1.5 мл.) 16. Амплификатор (ПЦР - аппарат) 17. Наборы праймеров В работе используют следующие праймеры Последовательности праймеров 26-53 293 -5- - 3 Процедура 1. Выделение вирусной РНК из клинического образца 1. Лизирующий раствор и раствор для отмывки(если они хранились при 2-8) прогреть до комнатной температуры. Промаркировать пробирки. 2. Внести в каждую пробирку по 100 мкл Раствора 1. Затем внести по 100 мкл исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером. 3. Тщательно перемешать, оставить на 10 минут при комнатной температуре. Затем на 1 час при 4. 4. Нагреть до комн. температуры и пипетировать лизат для разрушения ДНК (наконечник на 200 мкл). Центрифугировать при 10500 , 10 мин. 2 5. К осадку добавить 500 мкл Раствора 2 и деиоинизированной водой. Подготовленную смесь ресуспендировать вортексом (5 секунд). Затем обратной транскрипции помещают в термостат с центрифугировать 10000 , 10 мин. Супернатант установленной температурой 42 и инкубируют в удалить. течение 60 мин. Синтезируемая кДНК храниться 6. К осадку добавить 500 мкл Раствора 3, при минус 20 продолжительное время. перемешать и вортекс 5 сек. Центрифугировать 3. Проведение ПЦР 10000 , 10 мин. Супернатант удалить. Реакция 7. Повторить п. 6. Деонизировання вода 7 мкл 8. Удалить супернатант и сушить при 55 5 10 х ПЦР буфер 5 мкл мин. К осадку добавить 50 мкл РНК-элюента и дНТФ смесь 1 мкл инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Прямой праймер (30 рМ) 1 мкл 2. Синтез кДНК Обратный праймер (30 рМ) 1 мкл Реакцию обратной транскрипции проводят послеДНК полимераза 0,5 мкл получения РНК-пробы. Очищенная РНК может кДНК 5 мкл храниться до 4 часов при 2-8. Синтез к ДНК Общий объем 25 мкл проводят в микроцентрифужной пробирке типа Запрограммировать амплификатор в еппендорф. Для анализа одной пробы в пробирку соответствии с условиями термического вносят 10 мкл буфера для обратной транскрипции, циклирования. Запустить программу ПЦР, при этом ревертазу - 1 мкл, смесь универсального праймера и пробирки для ПЦР должны находится на льду. свободных нуклеотидов для синтеза к ДНК - 12 мкл, Дождаться, пока ПЦР аппарат нагреется до 50. 10 мкл пробы РНК и конечную концентрацию Затем поместить пробирки для ПЦР в амплификатор. реакционной смеси доводят до 50 мкл Условия термического циклирования Начальная ПЦР - активация Трехступенчатое циклирование Денатурация 4. Анализ результатов. Подговить агарозный гель, загрузить продукты ПЦР и маркер молекулярного веса. Визуалировать наличие маркера и ПЦР - продукта под ультрафиолетом или с помощью трансиллюминатора. Путем фотосъемки задокументировать картину с гелем. 5. Определение чувствительности ПЦР тестсистемы При определении чувствительности разработанной ПЦР тест-системы использовали отработанные оптимальные временные и температурные условия реакции. При определении чувствительности ПЦР тестсистемы использовали 10-кратные разведения РНК вируса гриппа В штамм В/Санкт-Петербург/30/09,линия , в концентрации от 10 нг до 0,1 фемтограмм. Чувствительность ПЦР тест-системы составила 1,0 пг кДНК вируса гриппа В. Результаты данного эксперимента представлены на фиг. 1. 6. Определение специфичности ПЦР тестсистемы В пробах, содержащих кДНК вируса гриппа В нарабатываются специфические продукты реакции размером около 267 п.о. Отрицательные результаты были получены при использовании в качестве матриц кДНК вирусов А/домашний гусь/Павлодар/05(Н 51),А/крачка/Южная Африка/61(35), А/лошадь/Отар/764/09(НЗМ 8),А/Астана/830/09(Н 11). Отсутствие каких-либо продуктов амплификации наблюдается и с деионизированной водой. Полученные результаты демонстрируют специфичность разработанного нами ПЦР тест-системы. Результаты работ по определению специфичности ПЦР тест-системы представлены на фиг. 2. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Тест-система для лабораторной диагностики вируса гриппа семействародатипаметодом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что для амплификации кДНК-фрагмента используют специфические праймеры следующего состава