Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антител к экскреторно-секреторному антигену протосколексов эхинокков

(51) 61 39/40 (2011.01) 12 5/12 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЭКСКРЕТОРНОСЕКРЕТОРНОМУ АНТИГЕНУ ПРОТОСКОЛЕКСОВ ЭХИНОККОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке тестов для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего МКА к экскреторно-секреторному антигену протосколексов эхинококков. Полученный штамм обозначают /31-,который хранится в РГП на ПХВ Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК под регистрационным номером - 0360. Моноклональные антитела могут быть использованы в качестве основных реагентов диагностической тест-системы для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Боровиков Сергей Николаевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Сураншиев Жанболат Амреевич Акибеков Оркен Султанхамитович Жумалин Айбек Хасиетович Абулгазимова Гульмира Алибаевна Дюсенова Гульшат Талаповна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. - ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ 25734 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке тестов для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных. В настоящее время основным способом прижизненной диагностики эхинококкоза у людей является рентгеноскопия. В ветеринарии существует внутрикожная проба Казони. В кожу животного в области шеи или в другом месте вводят 0,1-0,2 мл жидкости, взятой стерильно из эхинококкового пузыря. При положительной реакции у овец через 5-10 мин на месте инъекции появляется припухлость с красным ободком (диаметр 0,4-2,0 см), которая через 20 мин становится темно-багровой и отечной. Более выраженную реакцию получают от полноценного антигена,приготовленного из сколексов эхинококковых пузырей. Антиген, разведенный физиологическим раствором в соотношении 1750,вводят в толщу кожи верхнего века глаза овец в дозе 0,2 мл. Реакцию считают резко положительной, если припухлость свыше 18 мм положительной от 12 до 17 мм и сомнительной - до 9 мм диаметром. Измеряют припухлость через 1-3 ч штангенциркулем. Аллергическая - реакция при эхинококкозе дает положительные результаты начиная с 15-го дня после заражения (Абуладзе К.И. Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных. 1982). Несмотря на простоту,специфичность аллергической диагностики эхинококкоза оставляет желать лучшего. Кроме того, в данных способах используется визуальная (субъективная) оценка результата анализа,они не поддаются автоматизации и неудобны для проведения одновременно большого числа анализов. Разрабатываемые способы серологической диагностики ларвального эхинококкоза основанные на применении иммуноферментного анализа (ИФА),имеют большую перспективу в части внедрения в практику. Однако их общим недостатком является использование или антигена сложной природы или поликлональных антител, что снижает их специфичность, чувствительность и является главным препятствием при внедрении в диагностическую практику (.-,.. 2005,,,.-.2005 ). Общеизвестно, что специфичность ИФА можно существенно повысить за счет использования в качестве основного реагента способа моноклональных антител,характеризующиеся постоянными свойствами, т. е. имеющие моноклональное происхождение и доступные в неограниченном количестве. Наиболее близким к предлагаемому изобретению(прототипом) является разработка ученых 2,(Иордания). Полученные ими штаммы гибридных культивируемых клеток продуцируют моноклональные антитела специфичные антигену В эхинококков с молекулярной массой 8 кДа. ( . -, . -,-,. -.8 В (8/2). ,27,6,2008).смотря на это следует отметить, что антиген с такой молекулярной массой является диагностически менее ценным, а специфичные ему МКА могут вступать в реакцию с близкородственными антигенами. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела к экскреторносекреторному антигену протосколексов эхинококков. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг очищенного экскреторно-секреторного антигена в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 7, 11, 12,13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг этого же антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР),7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа(1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (Г). Через 10-14 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ТИФА с использованием экскреторно-секреторного антигена (ЭС-АГ) протосколексов эхинококков и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши,меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на среде с ГАТ и затем постепенно переводят на среду,содержащую гипоксантин-тимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток,продуцирующих МКА к ЭС-АГ, дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. 25734 Продуктивный клон гибридомы, обозначенный как /31- депонирован в РГП на ПХВ Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОИ РК (010000, г. Астана, ул. Ш. Уалиханова,13/1) под регистрационным номером - 0360 и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки адаптированы к росту в среде -1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ-глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 0,035-0,040 мг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов в ТИФА по отношению к исходному антигену составляют в культуральной жидкости - 11024, в асцитной жидкости - 125600. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса М. Константа связывания 2 х 10-9 М. Способы оценки специфичности МКА ТИФА. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 6-8 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5 х 106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды,отмывают один раз путем центрифугирования в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы /31- используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см 3 по 5105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии /, которым предварительно инъецировали пристан(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Специфичность определяют в ТИФА с использованием исходного ЭС-АГ,близкородственных и гомологичных антигенов. Для проведения ТИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют антиген в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР),1,2-1,А. Инкубируют при 4 в течение ночи или 2 часа при 37. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05 ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости(КЖ) или асцитной жидкости (АЖ) начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата(антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера,4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 0,5 М раствора 24. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической 3 25734 плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице 1. Таблице 1 Титры МКА Культуральная Асцитная жидкость жидкость Растворимые антигены экскреторно-секреторный антиген протосколексов эхинококков 2 соматический антиген 3 экскреторно-секреторный антиген трематод 4 соматический антиген трематод 5 соматический антиген трематодПримечание - РО - реакция отрицательная. 1 Как видно из приведенных в таблице 1 результатов, полученные моноклональные антитела проявляют высокую активность к экскреторносекреторному антигену протосколексов эхинококков. Так как при этом они не реагируют с соматическими антигенами других возбудителей других гельминтозов (циститицеркоз, описторхоз,меторхоз) можно сделать заключение о специфичности данных МКА к исходному антигену. Таким образом,результаты опыта свидетельствуют о специфичности МКА гибридомы/31- к экскреторно-секреторному антигену протосколексов эхинококков,что позволяет получать на их основе эффективные диагностические препараты для диагностики ларвального эхинококкоза. Пример 2. Электрофорез ЭС-АГ проводят в 10-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) на аппарате для вертикального электрофореза. Электрофорез проводят при силе тока 20 мА и напряжении 220 в. Электрофоретический перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляют с помощью прибора для иммуноблотинга. Перенос проводят при постоянной силе тока 0,8 мА/см геля в течение одного часа. Для иммунохимического проявления специфических антигенов нитроцеллюлозную мембрану сначала инкубируют в 1 растворе бычьего сывороточного альбумина(БСА) в течение ночи при 4 С. Затем отмывают по три раза ЗФР и ЗФР-Тв и выдерживают 1,5 ч при 37 в растворе моноклональных антител гибридомы /31- из очищенного асцитной жидкости, разведенной 1100 в ЗФР-Тв или нативной культуральной жидкости. После чего носитель вновь отмывают и инкубируют в рабочем разведении антивидовых антител,меченых пероксидазой хрена (1 ч при 37). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию по расщеплению субстрата. Раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием следующим образом 0,01 гр. 4-хлор-нафтола (, США),растворяют в 2 мл метанола, смешивают с 18 мл ЗФР. Результаты проведенного иммуноблоттинга показали специфичность моноклональных антител гибридомы /31- антигенной фракции ЭСАГ с молекулярной массой 18 кД. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных/31-,депонированный в РГП на ПХВ Республиканская коллекция микроорганизмов КН МОН РК под регистрационным номером 0360,продуцирующий моноклональные антитела к экскреторно-секреторному антигену протосколексов эхинокков.