Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием энхансерной последовательности «S+ARC»

(51) 12 15/00 (2010.01) 12 15/67 (2010.01) 12 15/09 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах относится к области биотехнологии растений,генетической инженерии растений и молекулярной биологии растений. Достигаемый технический результат повышение энхансерного эффекта, опосредуемого регуляторной последовательностью, расположенной в 5-нетранслируемой последовательности рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот. Предлагается при конструировании рекомбинантных кассет, использующихся для экспрессии генов в растительных системахи, помещать перед кодирующей областью гена нуклеотидную последовательность(5-3) для повышения уровня экспрессии рекомбинантных РНК. Данная нуклеотидная последовательность, находясь в 5 нетранслируемой последовательности рекомбинантной мРНК, способна повышать уровень ее экспрессии в 6,5 раза.(72) Искаков Булат Кудайбергенович Полимбетова Найля Сейтжановна Акбергенов Рашид Жагупарович Жаныбекова Сауле Шангереевна Жигайлов Андрей Викторович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭНХАНСЕРНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах относится к области биотехнологии растений,генетической инженерии растений и молекулярной биологии растений. Известен способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах путем помещения в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена природных энхансерных последовательностей вирусного происхождения ( , 5612193(А),- 1997-03-18). Данный способ заключается в помещении в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена 5-некодирующих последовательностей (5-НТП) геномных РНК вируса табачной мозаики , вируса мозаики костра , вируса мозаики люцерныи вируса желтой мозаики турнепсаи с целью повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов. Недостатками описанного способа является 1) использование последовательностей вирусного происхождения, которые теоретически могут способствовать раковой трансформации растительных клеток (Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений. - М. Наука, - 1985. -с. 195) 2) сравнительно большой размер используемых энхансерных последовательностей (5-НТП РНК 4 составляет 345 нуклеотидов 5-НТП геномной РНК- 69 нуклеотидов 5-НТП геномной РНК- 87 нуклеотидов 5-НТП РНКЗ- 91 нуклеотид), что существенно осложняет их синтез 3) зависимость работы энхансерных последовательностей, расположенных в 5-НТП мРНК-конструкций от наличия в составе мРНК 3 НТП геномных РНК соответствующих вирусов. Известен способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах путем помещения в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена искусственной энхансерной последовательности ( ,//. - 2004. - . 32, . 1. - . 239-247). Данный способ заключается в помещении в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена искусственной нуклеотидной последовательности(5-3), комплементарной участку 11131122 центрального домена пшеницы (.). Недостатком данного метода является низкая эффективность функционирования энхансерной последовательности. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах с использованием энхансерной последовательности для повышения энхансерного эффекта,2 опосредуемого регуляторной последовательностью,расположенной в 5-нетранслируемой последовательности рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот. Задача достигается тем, что для повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в растительных системах,в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена помещают энхансерную последовательность, но, в отличие от известного способа,в качестве энхансерной последовательности используют нуклеотидную последовательность(5(подчеркнут пунктирной линией). Поэтому нуклеотидная последовательность , в силу своей комплементарное и к центральному, и к Зконцевому району 18 рРНК растений, должна напрямую связываться с 18 рРНК в составе 40 рибосомных субчастиц, привлекая к мРНК дополнительное количество рибосомных субчастиц и повышая, таким образом, уровень их трансляции. Нуклеотидная последовательностьне является участком генома какого-либо вируса, ее размер составляет всего 50 нуклеотидов, а энхансерные свойства не зависят от конкретной ЗНТП. Эти свойства энхансерной последовательностиделают ее более удобной в качестве трансляционного усилителя по сравнению с энхансерными последовательностями вирусного происхождения. Причем энхансерный эффект,опосредуемый последовательностью, выше, чем у известной искусственной энхансерной последовательности . ДНК-фрагмент, содержащий в своем составе последовательность,может быть синтезировани встроен по сайтам рестрикции перед кодирующей областью различных рекомбинантных генов в ДНК-конструкции,позволяющие осуществлять экспрессию рекомбинантных геновидля повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов. Пример 1. В качестве примера приводится способ клонирования последовательностиперед репортерным геном , кодирующим 3 глюкуронидазуиз. Для встраивания последовательностив ДНК-конструкцию - (созданную на основе вектораП и содержащую промотор бактериофага Т 7, линкерный участок,включающий сайты рестрикции ,и ,репортерный гени З-НТП геномной РНК вируса табачной мозаики) по сайтам рестрикции- -3(нуклеотиды,формирующие сайты рестрикции, обозначены курсивом,а нуклеотиды,формирующие последовательность , подчеркнуты). Проводят отжиг этих двух олигонуклеотидов при температуре 96 С в течение 2 минут с последующим постепенным охлаждением до комнатной температуры. При этом образуется следующий ДНК-фрагмент 5335 5-концы полученного ДНК-фрагмента фосфорилируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т 4. Реакционная смесь объемом 50 мкл,содержит 100 мМ трис - (рН 8,0), 5 мМ ДТТ, 10 мМ 2, 0,05 мМ АТР, 20 единиц полинуклеотидкиназы фага Т 4 и 0,5 мкмоль описанного выше ДНК-фрагмента. Реакцию проводят при температуре 37 С в течение 30 минут. После окончания инкубации реакционную смесь депротеинизируют смесью фенолхлороформ в соотношении 11 (о/о). Для осаждения фосфорилированного ДНК-фрагмента к водной фазе прибавляют 0,8 объемов изопропанола, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут и центрифугируют на 20000 при комнатной температуре в течение 30 минут. Осадок промывают 70 этанолом, сушат на воздухе и растворяют в 20 мкл стерильной бидистиллированной воды. Лигирование фосфорилированного ДНКфрагмента,содержащего в своем составе последовательностьс векторной ДНК , обработанной рестриктазамии ,проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т 4. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержит 66 мМ трис-НС 1 (рН 7,6), 6,6 мМ 2, 10 мМ ДТТ, 0,066 мМ АТР, 100 нг векторной ДНК, 50 нг вставки и 1 ед. Т 4 ДНК-лигазы. Инкубацию проводят при температуре 12 С в течение 12 часов. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток бактерий Е.штамма -1,которые затем высаживают на твердую питательную среду Лурия-Бертани,содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Проводят скрининг колоний. Выделяют из бактерий ДНК-конструкцию - с использованием коммерческого набора для выделения плазмидной ДНКфирмыпо методике производителя. Таблица 1 Эффективность трансляции различных мРНК-конструкций в бесклеточной системе из зародышей пшеницы РНК-конструкция Среднее значение-активности, ед. флуоресценции Примечания 1 РНК-конструкция - перед репортерным геномсодержит линкерную последовательность (5-3), не обладающую энхансерными свойствами РНК-конструкция перед репортерным геномсодержит энхансерную последовательность , РНК-конструкция- перед репортерным геномсодержит энхансерную последовательность 2 значения-активности представлены в виде Хер, где Хер - значение среднего арифметического,- ошибка среднего арифметического. Таким образом, при помещении нуклеотидной ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ последовательности в 5-НТП Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантной мРНК-конструкции,эффективность экспрессии репортерного гена в рекомбинантных генов в растительных системах,помещение в экспрессионные бесклеточной системе из зародышей пшеницы включающий нуклеиновых кислот перед увеличивается в 6,5 раза по сравнению с конструкции областью гена энхансерной контрольной мРНК-конструкцией -, не кодирующей содержащей в своей 5-НТП энхансерных последовательности, отличающийся тем, что в энхансерной последовательности последовательностей (см. Таблицу 1). Энхансерный качестве эффект последовательностиболее чем в используют нуклеотидную последовательность 1,5 раза выше, чем у последовательности(5(см. уровень экспрессии мРНК-конструкции САСАА-3).