Способ выявления вторичных мутагенов

ВЕДОМСТВО ПРИ КАБИНЕТЕ МИНИСТРОВ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАНпроблем питания НАН РК(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления вторичных мутагенов. Цель изобретения повышение чувствительности способа. Цель достигается за счет использования микросом печени белых крыс, содержащихся на диете с дефицитом лизина, треонина,метионина и витаминов А, Е и С. Способ может быть использован в экспериментальиой онкологии, нутрицио логии гигиене окружающей среды и токсикологии. 6 табл.(56) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВТОРИЧНЫШ МУТАГЕНОВИзобретение ОТНОСИТСЯ К ОБПЗСТИ тамннную недостаточность моделируют исключением из состава диеты витамит нов АС и Е. Контрольные группы животных содержат на общевиварном рационе и сбалансированном полусинтетическом рационеПеред забоем, после содержания на вышеуказанных рационах в течение 1,52 меснцевд за 24 ч животных лишают корма. В качестве ферментнын систем для метаболической активации вторичных мутагенов используют микросот м печени. Экспериментально установ пене, что оптимальная концентрация микросомального белка а ннкубацион ной смеси 153 О мг/мл. В экспернг ментах использовали концентрацию белка в инкубацнонной смеси 2,0 мг/мл.методам оцени генетической опасно сти факторов окружающей среды, и предназначено для повьпиения чувствительности индикаторной тест-системы. для детектирования вторичнк мутагенов, нуждающихся в метаболической активации, и может быть исполъ зовано в экспериментальной онкологии,иутрициологии гигиене окружающей среды и токсикологии. Целью изобретения является повы шение чувствительности способа. Способ осуществляют следующим образом. Используют растущих крыссемцов.лиинм ВАГс исходной массой тела 50 916(П) (э) 21 (61)60 г. экспериментальным животных содержат на диете, н которой аминокислотный дисбалаис достигался путем замены 831 казеина на пнеимчную клейковинуиоторая оедна по содержанию лизина. треониндя метионна с ви Подготовка бактериальной культут ры Кулътуру(5 а 1 шопе 11 аурЬ 1 шиг 1 ош ТА 3535) с косяка переносят петлей в Еоуатнясо-лептонного бульона и подрацивают в термостате при 37 С в течение 18 ч. В ден постановки эксепернмента 5,0 мл ночной культуры переносят в 00 мл мясодпептонного бульона н подращмъают при 37 С до плотности 50 клеток при постоянном встряхивания. Содержимое колбы переносят в стернльные центрнфужные пробирки н центрнфутируют не центридттек 23 при 4 С при 5000 об/минВ инкубационную смесь, содержа щую 0,7 мл бактериальной суспензии,0,1 раствора хлористого магння(160 мМ) 0.2 мл 0,5 ММ раствора НАДФН, 0,3 мл суспензии мнкросоп добавляют в случае контрольных вариантов-0,2 мл дистиллированной воды, а в опытные варианты лнбо 0,2 ил И-нмтрозомор фолина до конечной концентрации200 мкг/мл, либо 0,2 пл циклофосфана до-конечной концентранни 500 мжг/мл инкубационную смесь выдерживают наводяной бане при 37 С в течение 30 минпри постоянном встряхивания. Реакцм останавливают добавлением 2,0 мл холодного 0,15 Мраствора хлористого калия. Затем инкубационную смесь центрифугнруют при 5000, об/мин в течет нне 10 мин. Осадок суспендируют аДля определения количества вышившх бактерий 0.5 мл суспензии разнос ДЯТ до ПТ 1 и 0,5 мл разведенной сус пенэин вносят в чашкис мясопептонДля учета количества ревертантов 0,25 мл цельной суспензии переносят в пробирки с 0,62-ным минимальным агаром (предварительно распланленны при 100 С) лперемешиеают. Содержимое пробирки разливают на чашжи Петрн с 1, 52-ньм питательным агаром н ннкуби-ддля учета выпивших бактерий под считывают количество колоний на чаш ках. среднее умножают на два н определают число жизнеспособных клетокв мл при данном разведеннны Путем перемножения этой величины на коэффинент разведения получают чнспо жизнеспособных клеток в искодном ввркхантеЧисло ревертантов определяют цутем перемножения среднего числа колоний на чашках на четыре н получают Число мутантов а 1 мл. Расчет частоты мутаций производят путем деления числа мутантов в 1 мл число выпивших клеток. Статистическую обработку полученных данных проводят по критеРи Стьщдента.ПЙР И М е р А. Эксперимент прозодятна трех группах КРЫС ЛИНИИ ВАГ. Первую группу крыс содержат на общениварном рационе. Вторая группа животных получает сбалансирован иую полусннтетическую диету (табл.1).Третью группу животных содержат на диете с дефицитом лизина, треонина метионина н витаминов А, С н ЕСостав солевой смеси полусинтетических диет приведен в табл. 3. Соо тав витаминов в табл. 4.В диету жнд вотных третьей группы витамины А,7 Т н Е не вводят.Животных содержат на вышеуказанных рационах в течение ,52 месяцев. В течение трех дней передэабоем все группы экспериентальных животных по лучают Ьнутрибрюшинно инъекпииифет нобарбитала Б дозе 80 мг/кг массы тела. Выделение препарата микросом печени крыс проводят общепринятым Методом.Данные по мутагенной метаболиче ской активации Ы-ннтрозоморфолнна н.Циклофосфана, при описанных выше экстПериментальных условнях приведены в табл. 5 н 6 соответственно.Как видно из табл., частота нн дуцированных мутаций вследствие метаболической активации Ы-интрозоморфопнна вне при нсполрзованйи бно материала животным, содержащихся на диете с дефицитом лизина, треонина,метионина и витаминов А,с н , по сравнению с другим группами животныж. Так. количество индуцированных мутаций сбноматериаломтретъей ГРУИН животых увеличнаается ь 1,5-6 раз но.сренненню с остальныи труппамм.Такая же направленность возрастания частоты индуцированшнх мутаций набюдаласъ при нсполъеованим в качестве тестируемого вторичного мутагенп Цилофосфана(табл,6). Как видно из. таблны.колнчество мутаций при все пользовании бноматериала животным третьей группы достоверно увеличитвалось в 1,52 раза по сравнению с другими группами животных.Таки образом, приведенные выше результаты показывают, что при усло 4 вин использования бноматернала от животных, содержавшихся на диете с дефицитом лизина, треонина, метионина н витаминов АС н Е, обеспечивается достоверное повыение чувствительности способа.Способ выявления вторичных мутагенов путем инкубации исследуемогоь вещества с микросомани печени в при сутствии бактерналънык клеток, отдепения бактериальных клеток, посева их на селективную среду и регистра ции числа колоний мутантных клетокч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа,используют микросоы, выделенные из печени животных,содержащнхсянадиете,дефицитной по неэаменимымаминокиспо ам лизину, треонниу, метионнну н витаминам А,С и Е не менее 1,5 меся-..- - АМИНОКИСЛОТИЬЙ дисбаланс ДОСТИГЗЛСЯ ПУТВН ЗЗМЕНЫ Ка-ЗЕННЗ на пшетм. - ВИТЗМНКНЗЯ НЕДОСТЗТОЧНОСТЬ НОЬеЛИр 0 В 8 Л 0 СЬ ИСКЛЮЧЕНИЕМ ИЗ составаТ а О л и ц а 3 Состав солевой смеси (мг/1 ООг)Мутагениая Метаболическая активация Ы-нитрозоморфопина микро сомани леченикрыс,соцержавшижся на различных диетах и инду цированных фенобарбиталом в дозе 80 мг/кг в течение трех дней(за 1001 принят уровень мутагенной активации Н-иитроз 6 морфоппна при использовании микросом печени крыс, содержавМутагенная Метаболическая активация цнклофосфанд мнкросомами печени крыссодержавшисяиареаличых диетах и иНдУЦированнЫх Фенобарбиталом в дозе 80 мг/кг а течениетрех дней (за 1002 принят уровень мутагенной активации дйкдофосфаиа при использовании микросом печени крыс.содержавшихся на общевивариом рационе)Верстка МП КРИЦ Шанин А.Н. , Шевченко А.В. , Семененко М.В. Ответственная за выпуск Фаизова Э.З.