Способ получения лейкоцитарного интерферона

ных в 1 л воды (РВЗ), и добавляют при интенсивном перемешивании к 17 л 20 мМ Трис-НС (рН 7,5). 1 мм Эдтук (ТЕ-буфер). 2 додецилсульфата натрия (ДСН) в делительную воронку емкостью 50 л. Прибавляют пронаау к 200 и г/мп и перемешивают раствор в течение 1 ч п и комнатной температуре. Прибавляют 10 отсч./мин 125 -глобин мРНК в качестве маркера для выделения поли/А/РНК. Прибавляют 2 М Трис-НС (рН 9) в количестве, равном 1/20 от общего объема (1/20 объемн), и смесь экстрагируют при энергичном перемешивании 15 л повторно перегнанного фенола в течение 10 мин. Прибавляют 3 л хлороформа и смесь перемешивают 5 мин. После 30 мин отстаивания для разделения фаз удаляют водную фазу, всего 19,1 л объединяют с 60 г ДСН. Нуклеиновые кислоты осаждают из водной фазы 1/10 объемн. ЗМ ацетатом натрия (рН 5,5) и 2 объемами этанола.После хранения в течение ночи при 20 С осадок нуклеиновых кислот отфильтровывают через пластиковое чайное сито. Этот материал затем перемешивают с 200 мл ТНЕ (50 ММ Трио-НС (рН 7,5), 100 мММаО, 5 мм ЭДТУК), содержащего 0,5 ДСН. Его последовательно растворяют при добавлении еще 350 мл этого раствора. Осадок собирают центрифугированием в бутылях емкостью 1 л в центрифуге Сорволл НС-З в течение 15 мин при 5000 об/мин и растворяют в 350 мл ТН Е. содержащего 0,5 ДСН. Оба раствора ТНЕ объединяют, экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола, 3 раза 1/2 объема эфира и 3 раза 1 объемом эфира. Из водной фазы выделяют всего 775 мг РНК.Поли(А) РНК смеси выделяют адсорбцией на олиго(оТ)целлюлозе. Прибавляют 2,7 г олиг.о(с 1 Т)целлюлозьк к 500 мл. После перемешивания в течение часа при комнатной температуре для проведения адсорбции поли(А)РНК на олиго(оТ)целлюлозе. центрифугируют целлюлозу и смесь мРНК,связанных с ней, промывают один раз 50 мл ТНЕ и второй раз 15 мл ТНЕ. Затем связанную поли(А)РНК злюируют пятью последовательными промывками 2 мл Н 2 О. Получают 860 и г поли(А)РНК. Надосадочный раствор РНК из первой адсорбции подвергают двум последующим циклам адсорбции. При второй и третьей адсорбциях получают 600 м г и 170 м г РНК.РНК испытывают на ЧеИФН-а активность путем инъекции в ооциты Хепориз 1 аеуйзРНК растворяют в 15 мл Трио-НС (рН 7,5), 88 мМ МаС 1 (ТН К буфер). чтобы получить концентрацию около 1 мг/мл. Инъецируют 50 мл этого раствора в каждые 50 ооцитов.Ооциты инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в среде Барта. Инкуби рованные ооциты затем промывают и гомогенизируют пипеткой Пастера в трубке для центрифуги Эппендорфа емкостью 1.5 мл в 0,5 мл 52 мМ трис-глицеринового буфера (рН 8.9). Смесь центрифугируют в течение 2 мин в центрифуге Эппендорфа. Надосадочный слой сливают и замораживают при-20 С для испытаний. Одна единица ИФНа снижает количество вируса на пластине на 50. Активность препарата ИФН-а выражается по отношению к известному человеческому ЧеИФН-а 69/19. Экстракт ооцитов имеет активность 300 Ш ИФН-а на д г РНК. при этом ооциты инкубируют в течение 48 ч. Для дальнейшей очистки поли(А)РНК добавляют 0.5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) к поли(А)РНК приготовления А для связывания концентрации 5 мМ ЭДТУК. Полученный раствор экстрагируют дважды равным объемом ТНЕ-насыщенного фенолом и 5 раз- равным объемом эфира. Затем его пропускают через колонку с 0.1 мл, нагрегую за 90 с до 100 С. и слоем в 13 мл с градиентом сахарозы 5 23, содержащей 50 мМ ТрисНС (рН 7.5). 1 мм ЭДТУК, 0,2 М МаС. В качестве маркера добавляют 10000 спм 55 концевого 32 р-меченых фрагментов ДНК. произведенных при одновременном усвоении рВК 322 и эндонуклеаз ниш и Рзт . Центрифугирование проводят в 5// 40 роторе при 10 С и 35000 об/мин в течение 16 ч. Фракции (0.6 мл) собирают с градиентом 5 СО коллектором при 1 мл/мин. Испытывают Фракции на ЧеИФН-а мРНК. их положение по отношению к 32 Р-ДНКмаркерам. При последующем центрифугировании фракции, содержащие ЧеИФН-а мРНК. идентифицируют относительно маркеров Фракции с активностью ЧеИФН-а мРНК содержат ЗОД г поли(А)РНК. Их смешивают с 2 объемами ТНЕ. содержащего 0,5 ДСН и 002 поливинилсульфата (в последних приготовлениях поливинилсупьфат был исключен). при этом применяют колонку с 50 у л олиго(оТ)целлюлозы. После промывки колонки 40,14 г смеси РНК злюируют 4 промывками 0.6 мл дистиллированной воды. После осаждения этанолом РН К растворяют в 1 мг/мл в 0,5 мМ ЭДТУК. . Испытание на активность ЧеИФН-а мРНК проводят, как описано выше. на порции осадка поли(А)РНК. Он имеет удельную активность 3600 Ш интерферона/мг. Следовательно. градиент сахарозы был обогащен поли(А)РНК примерно 1 О-кратно по отношению к ЧеИФН-а мРНК. Получают приготов 5Поли(А)РНК. обогащенную ИФН-а мРНК, используют в качестве шаблона (модели) для получения однониточной комплементарной ДНК (сдН К). ВООДЛ реакционной смеси содержит 40 мм Трио-НС (рН 7.5). 30 мМ МаС 1. 5 мм М 9 СЛ 2. 0.5 мм ДТТ. 20 мг/мл олиго(оТ)12 18. 5 ММ (ЮТР. астр и (ПТР. 5 мм 32 Р-оАТР (НЕН, удельная активность 10000 спм/нмоль), 60 мг/мл поли(А)РНК и 280 ед. обратной транскриптазы. После инкубации в течение 1 ч при 37 С прибавляют 0.5 М ЭДТУК и 20 ДСН (перекристаллизованного) к 10 мм ЭДТУК и 01 ДСН. Смесь экстрагируют 1 объемом фенола (перегнанного). Фенольную фазу промывают 200 и л 200 мМ Трио-НС (рН 7,5). 1 мМ ЭДТУК и 0,1 СДН. объединяют водные фазы. Их экстрагируют равным объемом эфира и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс 6-100 в ТНЕ. Собирают фракции по 0.1 мл при 0.3 мл/мин. Фракции. показывающие радиоактивность (как измерено по радиации Черенкова). объединяют и прибавляют зм. Нуклеиновые кислоты осаждают 2.5 объемами этанола. Послехранения в течение ночи при 20 С образцы центрифугируют, отбрасывают надосадочный слой. Осадок растворяют в 180 д л дистиллированной воды и переносят в силиконизированную трубку Эппендорфа. Прибавляют 20 и л БММаОН и хранят смесь при комнатной температуре в течение 40 мин. Прибавляют 20 мл БМ ацетата натрия. 100 мл дистиллированной воды и 500 мл этанола. После охлаждения в течение ночи при 20 С собирают полученный осадок центрифугированием при силе. эквивалентной 10000 кратной силе тяжести (10 О 0 Ох 9) в течение 20 мин при 0 С. Выход однониточной сДНК составляет 10 иг.Однониточный продукт сДНК находится в реальной сложной смеси большого числа различных сДНК. транскрибированных из соответствующих мРНК. имеющихся в смеси поли(А)РНК. Только очень немногие из этих сДНК имеют отношение к ИФН-а. например ННРМ-а сДНК.Определяют размеры различных однониточных сДНК с помощью электрофореза малого на щелочном 2-ном геле агарозы с использованием 30 мм МаОН. 2 мм ЭДТУК в качестве электролита. 32 Р-сДНК имеет дпину 600 1000 нуклеотидов. относящихся к однониточному глобину СДН К. 32 Р-мече 1880ные фрагменты ДНК используют в качестве маркеров размера.П р и м е р 2. Однонитевую сДНК превращают в двунитевую при обработке ДНК полимеразой 1. осажденную однонитевую сДНК растворяют в 200,11 л Н 2 О. нагретой до 100 С. в течение 2 мин и инкубируют в 50 Ои л 0.1 М нагретого денатурированного калийфосфатного буфера (рН 69) 10 мм М 9 С 12. 10 мм ДТТ, 1 мМ каждого из ОАТР,астр и остр, 1 мм Зн-аттр (нвну удельная активность 100000 спм/нмоль) и 150 ед./мл Есо 11 ДНК полимеразы 1. После 6,5 ч при 15 С прибавляют 0.5 ЭДТУК и 20 ДСН к 10 мм ЭДТУК и 0.1 ДСН. Затем смесь экстрагируют 500 дл фенола, фенольную фазу повторно экстрагируют 250 дл 20 мм Трио-НСфазы объединяют и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс 6-100 в тех же самых условиях. Прибавляют Зм ацетат натрия к 0.3 М и 2.5 объемам этанола, смешивают для осаждения ДНК. Всего собирают 13 иг ДНК.ДНК обрабатывают нуклеазой 51. Осажденную ДНК растворяют в 250 мл буфера(02 М МаСЛ. 50 мм ацетата натрия (рН 4.5). 10 мМ сульфата цинка и нагревают при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют 1.5 дл 51 фермента (11 единиц/ ул), смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют ДСН И ЭДТУК к 0,1 ДСН и 5 ММ ЭДТУК и экстрагируют смесь 250 мл фенола. Фенольную фазу промывают 100 ШТЕ буфера. Обьединяют водные Фазы и хроматографируют на колонке с Сефадексом 6-100 в ТНЕ. собирают фракции по 0.1 мл при скорэсти 0,3 мп/мин и определяют радиацию Черенкова для каждой фракции. После осаждения из этанола и ацетата натрия собирают 8 д г двойной спирали ДНК.(в частности. рВВ 322) андонуклеазой Рзт 1 и добавляют сЮмР хвосты концевой трансферазой. сЮМР добавляют к 5 концу плазмиды для регенерации Рэт 1 сайта и лигируют с сДНК фрагментом. несущим комплементарные хвосты. ДвунитевуюсДНК укдлиняют при добавлении оСМР хвостов к З концевому. Затем Плазмиду и сДНК обрабатывают лигазой, чем обеспечивается введение сДНК в подходящий сайт плазмиды и получение гибридной ДНК.П р и м е р 4. Плазмиду рВП 322 (20 г) гидролизуют 21 единицами Рзт эндонуклеазы в 150 мл 10 мм Трио-НС (рН 7.5), 6 мм М 9 С 12. 50 ММ МаС 1. 6 мм М 9 С 12. 50 мм МаС 1. б мм Ъмеркаптоэтанола. 200 мг/Дл бычьего сывороточного альбумина (БСА). После 2 чпри 37 С смесь экстрагируют 1 объемом фенолхлороформной смеси (11) и 1 объемом эфира и осаждают этанолом.Добавление гомопопимерных хвостов сЮМР с помощью терминальной деоксинуклеазидтрансферазы (ТсГГ) осуществляют в 328 мл реакционного объема, содержащего 100 мМ какодилата натрия (рН 7.2). 10 мМ МаН 2 РО 4 5 мМ М 9 С 2, 1 мМ сКЭТР. 50 мг/мл БСА и 3 - 6 ед. тат (очищенного как указано выше) на 1 мг ДНК. Инкубируют при З 7 С в течение 20 мин. Прибавляют ЭДТУК к 10 мМ. смесь экстрагируют как указано выше и диализуют два дня против буфера ТНЕ.Двунитевую ДНК удлиняют остатками оСМР по стандартной методике. Инкубируют 150 мл двунитевой сдНК, описанной выше, а 8 ил 100 мМ какодилата натрия (рН 7.2). 2.5 мм СоС 2. 50 дг/мл БСА. 0,2 мМ астк. содержащего 3 - 6 ед. очищенного тат на мг ДНК. в течение 8 мин при 27 С. а затем замораживают при -20 С.Инокулируют одну колонию Е.со 1 Х 776 в 100 мл триптоновой среды с добавкой 100 и г/мл диаминопимелиновой кислоты. 10 и г/мл налидиксовой кислоты и 10 иг/мл тетрациклина. Выращивают культуру при 37 С до кажущейся оптической плотности 0.6 при 650 нм (Одвво) И охлаждают на льду в течение 30 мин. Затем культуру седиментируют при 4000 об/мин в роторе. клетки промывают 50 мл 10 мМ МаС. отделяют на центрифуге и повторно суспендируют в 2 С мл 100 мМ СаС 2. Суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифугируют и снова суспендируют в 4 мл 100 мл 100 мМ СаС 2 и хранят на льду в течение ночи для использования. Аликвоты (0.5 мл) хранят замороженными при -70 С.Смешивают 3 нг оСМР-удлиненной ДНК с 22 нг оСМР-удлиненной Рвт . обработанной рВК 322 в 50 мл ТНЕбуфера. Инкубируют при четырех последовательны стадиях при 65. 46. 37 и 20 С. Прибавляют 20 ил 100 мм Трио-НС (рН 7,5), 100 мы СаС 2. 100 мМ М 9 С 2 и 50 ил ТНЕ буферасмесь охлаждают на льду 20 мин.Рекомбинантные молекулы РНК добав ляют к 100 ул обработанных Св клетоо Е.соН и смесь охлаждают на льду в течение 20 мин. нагревают до 20 С в течение 10 миъ и прибавляют 0,6 мл триптоновой среды Смесь помещают на 2 пластины с триптоно вой агаровой средой. подготовленные кал описано ранее. Эффективность трансфек ции составляет 3.3404 колоний на мг закаТак как плазмида рВК 322 включает ген устойчивости к тетрациклину, Е.соН реципиент, который был трансформирован плазмидой. будет расти в культуре. содержащей такой антибиотик. в отличие от нетрансформированных таким образом бактерий. Следовательно, рост в тетрациклиновой культуре позволяет провести селекцию организмов-хозяев. трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК или рециклизованным вектором.После 48 ч при 37 С пикируют индивидуальные колонии и суспендируют в 100 мл триптоновой среды (подготовленной. как описано выше) в углублениях микротитерных пластин. После инкубации при 37 С в течение ночи в каждом углублении смешивают 100 мл 40-ного глицерина. Пластины выдерживают при -20 С и готовят набор из 100000 индивидуальных клонов трансформированной Бсон Х 1776.П р и м е р 4. Рекомбинантные молекулы ДНК расщепляют, денатурируют и гибридизируют с лейкоцитами поли(А)РНК, содержащими ИФН-амРНК . Гибриды рекомбинантных молекул ДН К-поли(А)РН К отделяют от негибридизированной поли(А)РНК (стадия С). Поли(А)РНК выделяют из гибридов и очищают (стадия д). выделенную РНК испытывают на активность ИФН-амРНК (стадия Е), Смесь полученных рекомбинантных молекул ДНК содержит рекомбинантную молекулу ДНК с последовательностью нуклеотидов, способной гибридизироваться с поли(А)РНК в жестких условиях гибридизации, а также вызывает образование ИФН-ав ооцитах. Если группа из 512 клонов дает положительную реакцию, клоны перегруппировывают в 8 партий из 64 и каждую партию испытывают. Этот процесс продолжают до тех пор. пока не будет идентифицирован единичный клон. Однако полученные рекомбинантные клоны не содержать полную последовательность с ДНК ИФН-а.Бактериальные клоны инокулируют на агаровые пластины с триптоновой средой. После инкубации при 37 С каждый клон разрастается в колонию несколько миллиметров в диаметре. Все колонии отмывают с пластин и собирают. получают инокулум. использованный для инокулирования 1 л триптоновой среды. заполнившей, как описано выше. 2 л колбу Эрленмейера. Культуру встряхивают при 37 С до появления Одвэо примерно 0,8 (оценено визуально). Один объем триптоновой среды и хлорамфеникола до 170 иг/мл прибавляют к культуре, которую снова встряхивают при 37 С в течение 16 ч. Прибавляют 20 мл хлороформаи культуру снова встряхивают 10 мин при 37 С, чтобы удалить бактерии. Культуру декантируют с хлороформом. клетки собирают центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин при 4 С. Получают примерно 1 2 г клеток из каждого литра рецептуры. Клетки суспендируют в 30 мл 20 мМ Трио-НС (рН 7,5). центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин и 4 С. повторно суспендируют в 30 мл 50 мМ Трио-НС (рН 7.5). Прибавляют 0.25 объема раствора лизоцима (10 мг/мл в 50 мМ Трис-НС (рН 7.5. после охлаждения в течение 10 мин при 0 С прибавля ют 0.33 объема (считая на объем исходной суспензии 50 мМ Трис-НШ-культур). 0.5 М ЭДТУК (рН 8.0). осторожно перемешивают без встряхивания. Еще через 10 мин при 0 С прибавляют 1/16 объема (снова считая на первоначальный объем) 2 Тритона Х 100. Через 60 мин образец центрифугируют в течение 60 мин при 1000 об/мин и 0 С в роторе. Надосадочный слой переносят в лабораторный стакан с магнитной мешалкой и прибавляют 3 М МаОН при перемешивании до тех пор. пока не будет достигнут рН 12.5. измеряя при 20 С. используя стеклянный электрод и рН-метр. стандартизированный стандартным карбонатным буфером Бекманн рН 10 (Мг 3505). Послеперемешивания в течение 10 мин при 20 С устанавливают рН 8.5. После еще 3 мин перемешивания прибавляют 1/9 объема 5 М МаСЯ и 1 объем фенола (перегнанного и уравновешенного 9,5 М Мес) и интенсивно перемешивают еще 5 мин. Разделяют фазы центрифугированием при 10000 об/мин при 0 С в течение 10 мин. Надосадочный слой. содержащий форму 1 ДНК (круговая двуниточная ДНК). осторожно удаляют из промежуточной фазы(которая содержит однониточную ДНК) и З раза экстрагируют хлороформом. (Фенол должен быть полностью удален на этой стадии). Фракция 1 ДНК содержит рекомбинантные молекулы ДНК (рВК 322-сДНК вставка). первоначально использованные для трансформации этих клеток организмареципиента. которые образуют часть 512 клонов. выбранных для испытания. Прибавляют пан креатическую РНКазуА(5 мг/мл), предварительно нагретую в течение 10 мин при 85 С) к форме 1 ДНК до концентрации 20,14 г/мл и инкубируют смесь в течение 60 мин при 37 С. Прибавляют 1/5 объема 5 М МаС и смесь обрабатывают 30 полиэтипенгликолем 6000 до окончательной концентрации 7,5 ПЭГ. После 2 16 ч прив 0.075 М МаС 1. 0.0075 М цитрата натрия до поглощения 20 при 260 нм и доводят Е0,5 ДСН. Раствор инкубируют 30 мин при 37 С с 05 мг/мл проназы (20 мг/мл, 2 ч при 37 С) и 3 раза экстрагируют 1 объемом перегнанного фенола и 2 раза 1 объемом хлороформа. Центрифугируют образец (до 2 мл раствора ДНК на 1 мг/мл) при градиенте сахарозы от 5 до 23 в 50 мМ Трио-НС (рН 7.5). 1 мМ ЭДТУК в течение 15 ч при 21000 об/мин и 15 С. Собирают фракции и контролируют Од 2 во. Собирают фракции. содержащие ДНК, и осаждают ДНК ацетатом натрия и этанолом. Собирают центрифугированием 20 100 иг смеси ДНК.20 иг ДНК обрабатывают в 150 дл 10 мм Трис-НС (рН 7,5). б мМ М 9 С 12. 50 мМ МаСЪ 6 мМ 2-меркаптозтанола. 200 ш/мл БСА или желатина и 20 единиц Нйпо Ш. Эндонуклеазой ниш Н расщепляют ллазмиду рВК 322. После 2 часов при 37 С аликвоты (1 ) подвергают электрофорезу на 1 агарозном геле в 50 мМ трис-ацетате (рН 7.8), 2 мМ ЭДТУК в течение 1 ч при 50 мА, чтобы удостовериться о завершении рестрикции. Если обработка не закончена прибавляют еще Нйпо и продолжают инкубацию еще 2 ч. Когда ДНК полностью расщеплена. прибавляют проназу. ЭДТУК и ДСН в количестве 0.5 мг/мл. 10 мМ и 05 соответственно. После 30 мин при 37 С раствор экстрагируют 30 мл смесью фенол/хлороформ (11). Промывают 50 ул р-ра 20 мМ Трис-НС (рН 7,5). 1 мМ ЭДТУК. объединенные фазы экстрагируют 3 раза эфиром. фильтруют через колонку 01 мл. обработанную ЭДТУК. и осаждают 1/10 объема ацетата натрия и 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20 С ДНК собирают центрифугированием.Готовят две гибридизирующие смеси. Смесь 1 содержит 4 ил 10-кратно концентрированного буфера (4 М МаС. 0,1 ПИПС (рН 6.4. 1 д-пиперазиндизтансульфокислота). 50 мМ эдтук. 0.5 дл (около 5 нг 125 д-глобин мРНК (5000 спм) и 6 мл индуцированной лейкоцитарной попи(А)РНК (2 шпал). Смесь содержит 10 уг обработанной Нйло Н ДНК и 0.1 иг Р 5 т-2-рВКЗ 22 (НЗЖС ВСЕ 4.13 ДНК(производная рВКЗ 22 которая содержит последовательность В-глобина в Нйпс Ш сайте). Обе смеси сушат в парах газообразного азота. Прибавляют 40 мл 80 формамида к остатку смеси Н и денатурируют раствор в течение 10 мин при 100 С и быстро охлаждают на льду. денатурированный раствор используют для растворения смеси 1. а полученный раствор инкубируют при 5 бС в течение 4 ч.После разбавления до 1 мл холодным 0.9 М МаСК. 0,09 М цитратом натрия и 100