Способ очистки человеческого бета-интерферона

боковой цепью Аффиа-геля 10 еЧ(фирмы БиоРад лэб. именуемой ниже БиоРад 5 через пептидную связь с полисахаридным носителем. Можно также использовать другие носители, например поперечно связанный декстрановый гель, например Сефадекс (фирма Фармесиэ) и виниловый полимер с гидроксильнымм группам, который также можно использовать как носитель для для хелатметаллической хроматографии в следующей стадии, предпочтителен гидрофильнй гранулированный полимер, например, Тойопрл (фирма Тойо сода комп.).Предпочтительно использовать синий агарозовыйгель, соответствующи(В), так как он весьма эффективно связывается с интерфероном, не вызывает отделения красителя от носителя,поскольку соединение красителя с носителем является весьма стабильным в условиях рН от 6 до 13, и он легко доступен на рынке. Этот синий агарововый гель имеет следующую структуру и реализуется под товарным наименованием Блу сефароз СЬ 6 В(ФМа ФаРМг сиз) Матрекс гель блу А (фирма Амикон корп) и Аффи-гель блу(фирма Био-Рад), О ТЧЪ 11 ЕВвэ ЕК)3 Ъ тч йгЕц 33 О МНЖЫ Поперечно свя занный агарововый гельДля контактирования обездвиженного синего носителя с раствором сырого интерферона можно использовать либо порционный метод, либо колонный способ.П р и м е р 1. Раствор сырого интерферона бьш получен путем обработки человеческих фибробластовых клеток в среде МБМ Игла, содержавшей 0,4 метилцеллюлозы с поли 1 полн С, с последующей обработкой циклогексиммдом и актиномицином Д.К 30 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 6,21 л, 30 мл геля синей агарозы (Аффигель блу Фирмы Био-Рад). После перемешивания в течение 40 ч и вы 4держивания в течение 3 ч надосадочная жидкость была извлечена, и гель агарозы был перенесен в колонну, с промывкой физиологическим раствором,содержащм фосфатнокислотный буфер,Надосадочная жидкость была извлечена снова. Колонну дважды проывалн и злюировали. Использовали следующе промывочные растворы и элюент первый промывочный раствор(320 мл) раствор 1,0 М хлористого натрия, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2)содержащй 10 мм фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рн 7,2)элюент (400 шт) 55-ный раствор этиленгликоля,содержащий 10 мм фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рн 7,2).Получен выход частично очищенногоВ колонну с халатом цинка (10 мл) элюат (285 мл) и колонны геля синей агарозы пропустили при скорости потока 20 мл/г После двойной промвки колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюентдистиллированную воду н 0,Г М фосфорнокислого натрия (рн 6,7) использовали при скорости потока 30 м/г в течение 1 ч поочередновторой проывочнй раствор (50 мл)20 мМ раствор лимоннокнслого натрия (рн 5,0) элюент0,1 М буферный раствор уксусная кислота уксуснокислый натрийВыиод хелатцинковой хроматографи 87, а общий выход 702. достигнута очистка в 330 раз.Активность и выход интерферона,количество белка и удельная актив ность каждой стадии показан в табл..Анализ активности интерферона посредством электрофореза полиакриламидного геля.Часть конечного элюата подвергли диализу в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) и лиофилировали После восстановления лиофилнрованного диализата 2-меркаптоэтанолом восстановленный материал подвергли электрофорезу с использованием полиакрил амидного геля в присутствии НДС согласно способу Лэмли (Нейчзр, 227,680-685 (1970 для проведения анализа активности интерферона и красителя с блестящей синью В 200.В результате активность интерферона И темно-синяя полоса были обнаружены только в положении, соответствовавшем молекулярному весу примерно 2300 ОАнализ актииоммцииа Д был проведен способом биологической пробы.Часть конечного элюата обессолили путем гель-храатографии, используя Сефадекс О 25 после добавления сывороточного альбумина человека(1 мг/мл). добавляя дополнительно небольшое количество сывороточного альбумна человека и лактозы обессоленный элюат профильтровали через фльтр 2 мкм и лиофилировали. Актиномцин Д был обнаружен в количестве не больше О,ОО 03 мкг/10 имед. активности интерферона.Элюат из колонны геля синей агарозы содержал 0,7 мкг/м актиномци на Д. Общее количество актиномицина Д составило 210 мкг. Кроме того, присутствие актиноммцина Д в элюате из колонны геля синей агарозы было обнаружено по поглощению (430 им) и путем биопробы.Часть элюата из колонны геля синей агарозы обессолили способом гельхроматографии с использованием Сефадекс С-25 после добавления человеческого сывороточного альбумина,Удаляя этиленгликоль, обессоленный элюат лиофилировали. Все же было обнаружено около 0,7 мкг/106 имдедь интерферонной активности актиномици на Д.Пирогенное испытание на кроликах Полученный указанным выше способом из конечного элюата лиофилирован ный материал инъектировалн внутривенно трем кроликам (2-105 им.ед./кг6 массы кролика). Суммирование пирен сии для всех трех кроликов было 0,6 С Интерферон, очищенный попредлагаемому способу, оказался отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах.Лиофилированный материал, полученный из элюата колонны геля синей агарозы, инъектировали внутривенно трем кроликам (2-105 тпь ед/кг массы кролика) Суммирование пирексии для всех трех кроликов было 1,5 С. Интерферон, очнщенный согласно способу ХРОМЗТОГРЗФИИ синей агарозы, оказался неопределенно отрицательным к протеииому испытанию на кроликах.П Р И М е р 2. В этом эксперименте использовали раствор сырого интерферона, подобный использовавшемуся в примере 1.20 л раствора сырого интерферона пропустили через колонну синей агарозы объемом 20 мл (Матрекс гель блу А фирмы Амикои корп). Колонну трижды промли и элюировали. Использовали следующе промывочные растворы и элюентМ хлористый натрий, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рн 7,2). второй проывочный раствор(200 мл) 25-ный раствор этиленгликоля,Содержащй 10 мм фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2). третий прошивочный раствор(40 мл) 4 О 2 ный раствор этиленгликоля,содержащй 0 ММ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рн 7,2). элюент (200 мл)552 ий раствор этиленгликоля,содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натУияьХелатцинковую колонну (5 мл) соединили с выходом колонны синей агарозы после начала элюировании, и эпюат из колонны синей агарозы непосредственно пропускали через хелатцинко вую колонну. Затем хелатцинковую колонну дважды промыли и элюировали. Промывочные растворы и элюент были следующимвторой прошивочный раствор (20 мл)0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий,содержащий 1 М хлористого нат рия.Интерферонная активность, выход,количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл.2.П р и м е р 3. 20 л раствора сырого интерферона с интерферонной активностью 15-10 им. ед. и 60 мг/л общего белка контактировали с до мл синеагарозного носителя (Матрене гель Блу Аар фирмы Амикон корп.). Носитель, на который был адсорбирован интерферон, загрузили на колонну. Затем колонну дважда промыли и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюентраствор хлористого натрия 1 М,содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2).(400 мл) 252-ный раствор этиленгликоля,содержащй 10 ММ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рн 7,2).100 мл раствора интерферона, отобранного из колоны синей агарозы, пропустили через 5 мл хелатникелевую колонну. Использованная колонна халата никеля была приготовлена так же, как в примере 1, за исключением того, что вместо раствора хлористого цинка использовали раствор хлористого никеляХелатникелевую колонну промыли и элюировали. Использовали следующе промывочныи раствор и элюент0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокнслыйнатрий, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,5). Интерферонная активность, выход,количество белка и удельная активность каждой стадии показаиыв табл.3. Конечный элюат содержал весьма малое количество пирогеннык веществ и был отрицательным относительно испытания Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д.П р и м е р 4. Была повторена процедура примера 3 за тем исключением, что хелаткобальтовую колонну использовали вместо хелатникелевой колонны, причем хелаткобальтовую колонну приготовили как в примере 1,но вместо хлористого цинка использовали раствор хлористого кобальта. 6Элюат (15 мл) содержал 4510 им. ед, интерферона (выход 60) и 0,25 мг белка. Удельная активность составляла 1810 б ИМ, еда/Мг белка. Конечный элюат был отрицательным к испытанию Пимулуса. В нем не бышо обнаружено актиномицина Д.П р и м е р 5 Культивировали штамм Е. копи, в котором был интегрирован структурный ген Р-интерферона, и культивированный штамм подвергли процедурам сбора бактерий, измельчения бактерий, удаления нуклеиновой кислоты и осаждения сульфатом аммоний. Белковую фракцию, содержащую В-интерферон, полученнй из штамма Е.коли, растворили в 252-ном растворе этиленгликоля, содержащем 1 М хлористого натрия и О мм фосфорнокислого натрия (рН 7,2), с целью получения раствора сырого интерферона. Раствор сырого интерферона имел интерферонную активность 510 Имоедо И 20 мг белка на 1 мл.40 мл раствора сырого интерферона пропустили через колонну 2 мл синей агароэы (Матрекс гель блу А фирмы Амикон корп.), Уравновешенную буферным раствором фосфорнокислого натрия, содержащим 1 М хлористого натрия, Колонну дважды промыли с целью удаления примерно 952 белка в растворе сырого интерферона, И ЭПЮИР 0 вали с фракционированем в каждую фракцию 2 м. Использовали следующие промывочные растворы и элюентпервый промывочныи раствор (10 мл)второй промывочный раствор (10 мл)Элюат (12 мл) из колонны синей агарозы имел интерферонную активность 6-107 им.ед. (выход 80) и 4,6 мг белка. Средняя удельная активность в каждой фракции была 2,5-107 им.ед/мг белка (макс 5-10 им.ед/мг белка).Элюат подвергли анализу так же,как в примере 1. В результате чистота ннтерферонной активности при молеку лярном весе примерно 19000 составляла 10-50 (средняя 25).6 мл элюата из колонны синей агарозы пропустили через 1 мл хелатцинковой колонны, уравновешенной 602-ным раствором этиленгликоля, содержащим 1 М хлористого натрия и 1 мМ фосфорнокислого натрия Колонну трижды промыли н элюировали. Использовали следующе лроывочные растворы и элюентпервый промывочнй раствор (6 мл)60-ый раствор этиленгликоля содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мм фосфорнокислого натриявторой промывочный раствор (6 мл)третий промывочный раствор (6 мл)220 мМ буферный раствор фосфорнокислого натрия, содержащий0,1 М буферный раствор уксуснокислого натрия, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,0).Конечный элюат (4 м) имел интерферонную активность 4,0 т 107 им.ед.(выход 502) и 0,д мг белка. Удельная активность была 1-108 им. ед./мг белка.Конечный элюат подвергли анализу как и в примере 1 и обнаружили одну полосу в положении молекулярного веса примерно 19000. Чистота была больше 97.П р и м е р Ь. Была ловторена процедура примера З, за тем исключениецчто вместо хелатникелевой колонны использовали хелатцинховую колонну и в качестве элюеита использовали 0,2 Ъ раствор 1 гГНСТИдНН уравновешенный хлористый натрием (рН 7,0).Элюат (20 мл) имел 50-10 им.ед. интерферона (выход 672) и 50 г общего белка. Удельная активность была 1,0-0 им.ед./мг белка, П р и м е р 7. Использовали сырой интерферон, полученный из человеческих фибробластовых клеток, аналогичный интерферону, использованному в примере 1.К 20 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 42-06 имед. и концентрацией белка -70 мг/л добавили 30 мл геля синей агарозы(Мартен 0 е 1 В 1 ие АдАт 1 соп сотр) После перемешивания смеси в течене 3 сут и выдержки в течение Здч удалили надосадочный слой и гель синей агарозы пропустили через колонну,лромвая 200 мл 1,0 М раствора хлористого натрия, содержащего 10 мМ фосфата натрия с рН 7,2 (буфер А).Затем колонну дважды промыли. Перед элюированием интерферона для улучшения очистки к выходу вышеуказанной колонки подсоедивли колонку с 15 мл свежего геля агароэы уравновешенного буфером А содержащм 25 ный раствор этиленгликоля. После третьей промывки интерферон элюировали. Использовали следующе промывочные растворы И эпюентпервый промывочный раствор (200 мл) буфер Авторой промывочный раствор (300 мл) буфер А, содержащий 25-раствор этиленгликоля, третий промывочный раствор (120 мл) 3 М раствор хлористого натрия,содержащй 30 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2) и 30-ный раствор этиленгликоля, элюент (600 мл) буфер А, содержащий 55-ны раствор этиленгликоля.Результаты представлены в табл.4 фракцию второго элюированя лод вергли дальнейшей очистке с помощю хелатцинковой хроматографии.