Закваска «Казбиосил» для силосования растительных кормов (варианты)

(51) 23 3/02 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) 12 1/02 (2010.01) 12 1/46 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ определенного вида растительного сырья штамм молочнокислых бактерий, отличающиеся тем, что в качестве молочнокислых бактерий содержит штаммАК-41. 2. Закваска для силосования растительных кормов, включающая специализированные для определенного вида растительного сырья штамм молочнокислых бактерий, отличающиеся тем, что в качестве молочнокислых бактерий содержит штаммА-25. 3. Закваска для силосования растительных кормов, включающая специализированные для определенного вида растительного сырья штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий,отличающиеся тем, что в качестве молочнокислых бактерий содержит штаммАК-41 и штамм пропионовокислых бактерий -С-8. Техническим результатом является получение бактериальных заквасок на основе более активных штаммов молочнокислых бактерийАК-41 иА-25 и пропионовокислых бактерийС-8.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Айткельдиева Светлана Айткельдиновна Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан Саданов Аманкелди Курбанович Айткельдиева Светлана Айткельдиновна Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна(56) ОСТ 64-042-87. Отраслевой стандарт// Закваски бактериальные для силосования кормов сухие(54) ЗАКВАСКА КАЗБИОСИЛ ДЛЯ СИЛОСОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ КОРМОВ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для силосования растительных кормов с помощью молочнокислых и пропионовокислых бактерий. 1. Закваска для силосования растительных кормов, включающая специализированный для Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для силосования растительных кормов с помощью молочнокислых и пропионовокислых бактерий. Известна закваска для силосования кормов Биотроф на основе штамма молочнокислых бактерий(Патент РФ 2168909, 20.06.2001), которая рекомендуется для силосования трав и кукурузы (свидетельство о регистрации Россельхознадзор)ПВР-1-1.4/01369 на выпускаемую закваску). Недостатком данной закваски является использование ее для консервирования растительного сырья без учета его химического состава. Известен также препарат Лактобифадол для силосования кукурузы (Патент 2239331 от 10.11.2004 г),содержащий ацидофильные и бифидобактерии,высушенные сорбционным методом на естественном растительном носителе. Применение биопрепарата способствует улучшению качества получаемого корма за счет активизации биохимических процессов. Недостатком препарата является его неспособность предохранять силос из высокосахаристых растений от перекисления, что может вызвать ацидозы у животных. Наиболее близким техническим решением является использование сухих и пастообразных заквасок АМС, ПКБ, ПМБ, специализированных для определенного вида растительного сырья (ОСТ 64042-87 Отраслевой стандарт Закваски бактериальные для силосования кормов сухие). Закваска АМС создана на основе штамма ВК-23,предназначенного для силосования трудносилосуемых растений(тростника,дикорастущих трав, люцерны и др.). Штамм способен восполнять запас легкосбраживаемых сахаров за счет расщепления крахмала силосуемого сырья(Казахские силосные закваски. Казинформагропром,1990 Предварительный патент РК 940980.1,1997, Оф. бюл.3). Недостатком штаммаВК-23 является недостаточно высокий титр бактерий в готовом препарате. Для получения умеренно кислого силоса из высокосахаристых растений предложено использовать закваску из пропионовокислых бактерий(АМС). Пропионовокислые бактерии способны раскислять силос из высокосахаристых растений переводом избыточного количества молочной кислоты в менее диссоциированные, но обладающие сильными фунгистатическими свойствами пропионовую и уксусную кислоты, благодаря чему силос не плесневеет. Происходит также обогащение силоса витаминами В 12 и В 2 за счет их биосинтеза пропионовокислыми бактериями. Недостатком используемого штамма пропионовокислых бактерий является недостаточный уровень биосинтеза витамина В 12. Закваска ПМБ на основе штамма молочнокислых бактерий, выделенного из спиртово-зерновой барды Березиной Г.О. и Саубеновой М.Г. (А.с.732387, 1983 г.),способного сбраживать пентозы растительного сырья. Применение бактериальной закваски при силосовании соломы позволяет получить корм с высокой долей молочной кислоты, оптимальным соотношением молочной и уксусной кислот и отсутствием масляной кислоты. Добавка указанной закваски при силосовании соломы улучшает переваримость питательных веществ. Питательность 1 кг корма увеличивается с 0,21 до 0,29 кормовых единиц (Обзорная информация. Казахские силосные закваски. Казинформагропром, 1990). Недостатком штаммаявляется недостаточно высокий титр бактерий в готовом препарате. Задачей изобретения является создание более эффективных препаратов для силосования растительных кормов за счет повышения активности штаммов бактерий, входящих в состав препаратов. Это достигается тем, что в закваску (АМС) для силосования трудносилосуемых растений введен новый штамм бактерийАК-41, способный более эффективно накапливать биомассу и органические кислоты при сбраживании крахмала, в закваску (ПКБ) для силосования кукурузы и других высокосахаристых растений - штамм пропионовокислых бактерийС-8 с повышенной способностью к синтезу витаминов группы В, в закваску для силосования соломы (ПМБ) - штамм бактерий А-25,способный более эффективно накапливать биомассу и органических кислот при сбраживании пентоз. ШтаммыАК-41,-8,А-25 получены из исходных штаммов бактерий в результате отбора активных вариантов,возникающих в процессе производства сублимационно высушенных препаратов. Штаммы характеризуются следующими морфолого-культуральными и физиологобиохимическими признаками. ШтаммАК-41 по морфологическим признакам представляет собой кокки, одиночные и в виде цепочек по 2-5-12 и более. Клетки мелкие, не превышают в диаметре 0,7 ммк, неподвижные. Спор не образуют,грамположительные,хорошо окрашиваются метиленовой синью 1100. В чашках Петри на питательных средах растет в виде отдельных круглых и чечевицеобразных колоний диаметром 1,5-2 мм. Колонии после 3-4 суточного выращивания на среде с крахмалом при температуре 37 С обязательно образуют вокруг себя зоны гидролиза крахмала, которые видны после обработки поверхности среды раствором Люголя. Факультативный анаэроб. Сбраживает глюкозу,сахарозу, рафинозу, мальтозу, лактозу, галактозу,дульцит, декстрины, крахмал. Слабо сбраживает маннит, глицерин, ксилозу, арабинозу. Из источников азота усваивает пептон, мочевину, 24804 автолизат дрожжей. Оптимальная температура роста 35-37 С, рН-6,8-7,0. Проявляет антагонистические свойства по отношению к гнилостным бактериям и микроскопическим грибам, встречающимся в силосе,, , а ,, ,. ШтаммАК-41 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии под номером ИМиВ В-82. ШтаммС-8 ИМВ представляет собой палочки с закругленными концами, размером 0,5-1,52,0 мкм, грамположительные,неподвижные,аспорогенные. Однако морфология и размеры клеток меняются в зависимости от условий культивирования и состава питательной среды. Клетки могут быть кокковидными при росте в среде без кобальта, при рН 4,5-5,0, а также при температуре 35-37 С(оптимальные температура роста 28-30 С, рН - 6,87,0). Сбраживает лактозу, сахарозу, мальтозу,глюкозу, арабинозу, маннит, использует молочную,винную, хинную кислоты, глицерин. Усваивает различные источники азота, начиная от сложных их форм и кончая солями аммония. Продуцирует витамин В 12. Обладает каталазной активностью. Является факультативным анаэробом, но лучше растет в анаэробных условиях. Проявляет антагонистические свойства по отношению к гнилостным бактериям и микроскопическим грибам, встречающимся в силосе,, ,,,. Штамм-8 ИМВ депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии под номером ИМиВ В-83. Штамм А-25 представляет собой клетки в форме палочек с закругленными концами 2,00,9 мкм в коротких цепочках,неподвижные,аспорогенные,грамположительные. Микроколонии на агаре незначительно выпуклые с цельным краем,непрозрачные, серо-белые, по консистенции маслянистые с гладкой поверхностью. Факультативный анаэроб. Сбраживает ксилозу,арабинозу, глюкозу, сахарозу, рамнозу, мальтозу,лактозу,маннит,галактозу,декстрин с образованием молочной и уксусной кислот. Усваивает различные источники азота сернокислый и лимоннокислый аммоний, пептон, мочевину,вытяжку из печени, автолизат дрожжей. Активный кислотообразователь при использовании пентозных сахаров непищевого сырья. Оптимальная температура роста 30-32 С, рН-4,5-5,5. Проявляет антагонистические свойства по отношению к гнилостным бактериям и микроскопическим грибам,встречающимся в силосе, ,, а , ,,. А-25 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии под номером ИМиВ В-84. Закваски на основе указанных штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий выпускается в сухом и пастообразном виде с титром не менее 10109 КОЕ/г. Срок хранения сухой закваски при температуре 4-8 С 12 месяцев,пастообразной - 6 месяцев. По результатам испытаний препаратов при силосовании растительных кормов установлена их более высокая эффективность по сравнению с исходными. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1. Исходный штаммВК-23 и предлагаемый штамАК-41 выращивают на питательной среде следующего состава, (г/л) 1. Кукурузный экстракт ОСТ 18206- 15,0(по сухому веществу) Крахмал растворимый - 10,0 СаСО 3- 10,0 Дрожжевой автолизат - 10,0 Вода питьевая (из расчета доведения объема среды до 1 л). Исходный штамми предлагаемый штаммС 8 выращивают на питательной среде следующего состава, (г/л) Кукурузный экстракт - 15,0 (по сухому веществу) Глюкоза - 20,0 Аммоний сернокислый - 3,0 Кобальт хлористый - 0,01 Мел - 20,0 Вода питьевая - до 1 литра. Исходный штамми предлагаемый штаммА 25 выращивают на питательной среде следующего состава (г/л) Кукурузный экстракт ОСТ 18206- 15,0(по сухому веществу) Ксилоза- 20,0- 2,0 0 4 - 1,0 СаСО 3 - 10,0 Вода питьевая (из расчета доведения объема среды до 1 л). Культивирование производят в термостате при температуре 28-30 С (ПКБ, ПМБ) и при 35-37 С(АМС) в течение 18-20 ч, затем в жидких культурах определяют титр бактерий путем высева из соответствующих разведений в твердую питательную среду и органические кислоты в градусах Тернер и по Вигнеру, содержание витамина В 12 - методом диффузии в агар с использованием витамин - зависимого штамма 113-3. Как видно из таблицы 1, штаммАК-41 при росте на среде с крахмалом превосходит исходный штамм по накоплению бактериальных клеток в 2 раза и 3 молочной кислоты в 1,3 раза. ШтаммА-25 при росте на среде с ксилозой превосходит исходный штамм по накоплению бактериальных клеток в 3 раза и органических кислот более чем в 2 раза. Наличие свободной масляной кислоты у исследованных штаммов не выявлено. Результаты, представленные в таблице 2,свидетельствуют, что штаммС-8 превосходит исходный по накоплению бактериальных клеток в 3,6 раза, витамина В 12 в 2 раза. Пример 2. Штаммы перечисленных выше молочнокислых и пропионовокислых бактерий выращивают аналогично примеру 1. Через 24 ч культивирования в них определяют антагонистическую активность методом диффузии в агар по отношению к гнилостным бактериям и микроскопическим грибам, встречающимся в силосе. Как видно из представленной таблицы 3, новые штаммы молочнокислых бактерийАК-41,-25 и пропионовокислых бактерийС-8 обладают более выраженными антагонистическими свойствами по сравнению с исходными. Пример 3. Получение пастообразной закваски для силосования кормов. При наработке биопрепаратов используют штаммы бактерий(ПКБ) исходный и С-8. Маточную расплодку штаммов выращивают на питательных средах аналогичного состава,описанного в примере 1, в колбах в термостате при температуре 28-30 С (ПКБ, ПМБ) и при 35-37 С(АМС) в течение 18-20 ч. Засев колб с 300 мл питательной среды культурами молочнокислых и пропионовокислых бактерий производят со скошенной агаризованной среды. Посевной материал молочнокислых и пропионовокислых бактерий выращивают в колбах в количестве 1,5 л в течение 20 ч на питательных средах следующего состава,АМС иПМБ ПКБ Кукурузный экстракт 1,5 1,5 Глюкоза 0,0 1,0 Сахар-песок 1,0 0,0 Аммоний сернокислый 0,0 0,3 Кобальт хлористый 0,0 1,0 мг Вода питьевая остальное Наработку культуральной жидкости молочнокислых и пропионовокислых бактерий производят в ферментере вместимостью 30 л без аэрации при избыточном давлении 0,3-0,5 атм. на питательной среде для посевного материала. Питательную среду готовят в ферментере и стерилизуют при 121 С в течение 30 минут. После охлаждения до 28 С ее засевают пятью процентами посевного материала. Культивирование производят при следующем режиме Температура культивирования 28-30 С(ПКБ и ПМБ) 35-37 С (АМС) Избыточное давление в аппарате 0,3-0,5 атм. Время культивирования 18-24 час. В культуральную жидкость, полученную после ферментации, добавляют растворенный в питьевой воде бентонит (3) и хлористый кальций (0,1),смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. За это время биомасса адсорбируется на бентоните и осаждается. Надосадочную жидкость декантируют,а оставшийся осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. В отцентрифугированную биомассу бактерий добавляют 1 уксуснокислого натрия и перемешивают на механической мешалке. Получают биомассу бактерий, адсорбированную на бентоните. Результаты опыта (таблица 4) свидетельствуют о повышенной продуктивности новых штаммов в сравнении с исходными. При этом повышается выход пастообразных препаратов и содержание в них бактериальных клеток. Активность полученных препаратов сохраняется в течение 6 месяцев при температуре не выше 8 С(таблица 5). Пример 4. Получение сухих заквасок для силосования кормов. Культуры бактерий выращивают аналогично примеру 3, за исключением того, что в состав питательных сред для посевного материала и производственных культур дополнительно вводят 0,5 крахмала. Жидкие культуры центрифугируют. В полученную биомассу бактерий добавляют 0,5 тиомочевины и хорошо перемешивают на механической мешалке. Затем бактериальную пасту высушивают сублимационным способом при следующем режиме замораживание продукта при 40 С в течение 6 часов температура плит - 10 С температура досушивания продукта 20-25 С разряжение 45 мА продолжительность сушки 20-24 часа. Как видно из таблицы 6, введение в состав препаратов новых штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий позволяет повысить число жизнеспособных клеток в культуральной жидкости, бактериальной пасте и сухом препарате при сублимационном высушивании. Пример 5. Испытание препаратов на основе новых штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий при силосовании кормов в сравнении с исходными. Закваски, состоящие из чистых культурВК-23 и АК-41, вносят каждую отдельно в силосуемую массу люцерны в количестве 2 мл на 1 кг силосуемой массы с содержанием 1 млрд КОЕ/мл. Закваски, состоящие из смеси чистых культурив одинаковом соотношении исходных и новых штаммов, вносят каждую отдельно в силосуемую массу кукурузы в количестве 2 мл на 1 кг силосуемой массы с содержанием 1 млрд. КОЕ/мл. Закваски, состоящие из чистых культурисходный штамм и А-25,вносят каждую отдельно в силосуемую массу соломы в количестве 2 мл на 1 кг силосуемой массы с содержанием 1 млрд. КОЕ/мл. В силосуемую массу вносят также по 1 поваренной соли. Измельченную растительную массу впрессовывают в банки вместимостью 1 л, закрывают пергаментной бумагой и заливают смесью Менделеева, состоящую из парафина и сургуча. В контрольный вариант закваски не добавляют. По истечении 6 месяцев банки с силосом вскрывают и анализируют. Установлено (таблица 7), что использование биопрепарата на основе нового штамма АК-41 при силосовании трудносилосуемых растений (люцерна) способствует активации бродильного процесса с накоплением в силосе до 1,9 молочной кислоты и 0,6 свободной уксусной кислоты по сравнению с 1,4 молочной кислоты и 0,8 уксусной кислоты - с исходным штаммом ВК-23. При этом в опытном силосе содержится больше на 2,2 белка и 2,7 сырого протеина по сравнению с исходным штаммом. Использование новых штаммов пропионовокислых и молочнокислых бактерий при силосовании высокосахаристых растений позволяет получить умеренно кислый силос с повышенным содержанием сырого протеина (на 4,4 ), витаминов В 12 (на 1,64 мкг/г) и В 2 (на 9,64 мкг/г) по сравнению с исходными штаммами (таблица 8). Исследования показали (таблица 9), что применение бактериальной закваски ПМБ А-25 при силосовании соломы позволяет получить корм с более высокой долей молочной кислоты,оптимальным соотношением молочной и уксусной кислот по сравнению с исходным штаммом. Таким образом, получены новые штаммы молочнокислых бактерий АК-41 иА-25,являющиеся более продуктивными и превосхоящие исходные штаммы по накоплению бактериальных клеток в 2-3 раза, органических кислот в 1,3-2 раза. ШтаммС-8 превосходит исходный по накоплению бактериальных клеток в 3,6 раза и витамина В 12 в 2 раза. У предлагаемых штаммов значительно повышена антимикробная активность по отношению к гнилостным бактериям и микроскопическим грибам, встречающимся в силосе. Использование новых штаммов бактерий позволило повысить число жизнеспособных клеток в жидких, пастообразных и сухих препаратах и улучшить качество силосованных кормов за счет увеличения в них долей молочной кислоты, протеина,витаминов группы В, оптимального соотношением молочной и уксусной кислот. Таблица 1 Сравнительная характеристика продуктивности штаммов молочнокислых бактерий Штамм Титр,Органические кислоты,млрд.,свободные связанные КОЕ/мл Уксусная Молочная Уксусная Масляная Закваска АМС 1,4 0,7 2,7 1,1 0,0 3,0 0,8 3,5 1,2 0,0 Закваска ПМБ 0,6 0,30 2,80 0,6 0,0 1,9 0,55 1,04 0,6 0,0 Таблица 2 Сравнительная характеристика продуктивности штаммов пропионовокислых бактерий Штамм Антагонистическая активность исследуемых штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий Штаммы Зоны подавления роста тест-культур, мм 1 Результаты опыта по получению пастообразного препарата с использованием новых штаммов бактерий Штаммы бактерий Объем плотного осадка, Все пасты после центрифугирования,г Сохранение жизнеспособных клеток в бактериальной пасте Штаммы бактерий Таблица 6 Показатели качества сухих препаратов , полученных сублимационным способом Титр культураль ной жидкости млрд. КОЕ/мл ПКБ исходный ПКБ С-8 АМС ВК-23 АМС АК-41 ПМБ исходный ПМБ А-25 Молочная кислота Контроль,без закваски АМС ВК 23 АМС АК 41 Таблица 8 Качество силоса из кукурузы, приготовленного с участием биоконсерванта ПКБАМС с различными штаммами бактерий Органические кислоты,Варианты Сырой протеин,к Масляная сухому кислота веществу Контроль,4,0 без закваски ПКБ исходный 4,3 АМС ВК-23 23 ПКБ С-8 Таблица 9 Качество силоса из пшеничной соломы, приготовленного с различными штаммами пентозосбраживающих молочнокислых бактерий Варианты Контроль без закваски ПМБ исходный ПМБ А-25 1. Закваска для силосования растительных кормов, включающая специализированный для определенного вида растительного сырья штамм молочнокислых бактерий, отличающаяся тем, что в качестве молочнокислых бактерий содержит штаммАК-41. 2. Закваска для силосования растительных кормов, включающая специализированные для определенного вида растительного сырья штамм 0,0 1,72 81,4 18,6 молочнокислых бактерий, отличающаяся тем,что в качестве молочнокислых бактерий содержит штаммА-25. 3. Закваска для силосования растительных кормов, включающая специализированные для определенного вида растительного сырья штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий,отличающаяся тем, что в качестве молочнокислых бактерий содержит штаммАК-41 и штамм пропионовокислых бактерий--8.