Способ получения “биодена” – препарата, деградирующего нефть

(51) 09 1/10 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Для глубинного выращивания используют среду ВДМК. Рабочие партии углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях стерильного микробиологического бокса пересевают со скошенного агара в колбы Эйленмейера объемом 0,75 л со стерильной средой в объеме 0,1 л для наработки посевного материала. В инокуляторе проводят смешивание маточной культуры всех четырех штаммов. Через 20-24 часа эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. Культивирование заканчивается к 20-25 часам роста. Окончание процесса культивирования определяют микроскопированием мазка культуры в поле зрения должно быть не менее 2 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости. Концентрирование полученной культуральной жидкости проводят сепарированием или центрифугированием. Концентрат высушивают на распылительной сушилке. Затем проводят стандартизацию препарата наполнителем минеральными солями, рыбной мукой и кормовыми дрожжами. Получают сухой порошок.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Нурлыбеков Азамат Нурлыбекович Черемисова Татьяна Геннадьевна Масалимов Жаксылык Кайырбекович Барбасова Сауле Кабденовна Апендина Гульжанат Серикбаевна Туякбаева Акмарал Усерхановна Курманбаева Асылай Бактыбаевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕНА ПРЕПАРАТА, ДЕГРАДИРУЮЩЕГО НЕФТЬ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии, биотехнологии, к производству бактериальных препаратов,предназначенных для биоремедиации нефтезагрязненных земель. Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии, биотехнологии, к производству бактериальных препаратов,предназначенных для биоремедиации нефтезагрязненных земель. Нефтепродукты принадлежат к числу наиболее распространенных и опасных загрязнений природной среды, как по объему поступления, так и по воздействию на экосистему. В настоящее время в арсенале экологических служб и организаций,занимающихся рекультивацией нефтезагрязненных почв, уже имеется большой набор механических, физикохимических и химических способов очистки почвы от нефтепродуктов. Физические, термические и химические методы разрушения нефтяных углеводородов, несмотря на то, что способствуют интенсификации их разложения, не обеспечивают их полное удаление из почвенного слоя, кроме того, могут являться дополнительным источником поступления загрязняющих веществ в окружающую среду. Известно, что в процессах самоочищения природных сред от нефтяных загрязнений, ведущую роль играют микроорганизмы. Они обладают высокой пластичностью,имеют мощные ферментные системы,благодаря которым загрязняющие вещества минерализуются и разрушаются. Как показывает практика,применение биопрепаратов, как правило, оправдывает себя в системах интенсивной очистки. Казахстан входит в число основных экспортеров черного золота, разведанные запасы нефти составляют более 40 миллиардов баррелей, выводя страну на 11 место. Республика имеет грандиозные планы, направленные на увеличение добычи сырой нефти до 150 миллионов тонн к 2015 году. Вместе с тем, во много раз возрастает нагрузка на окружающую среду - при промышленной добыче и транспортировке сырой нефти неизбежно возникают аварийные чрезвычайные ситуации на транспорте и трубопроводах,утечки из нефтехранилищ,образование нефтесодержащих сточных вод и нефтяных шламов. В индустриальных районах Казахстана сложилась напряженная экологическая ситуация в связи с загрязнением почвы нефтью и продуктами ее переработки. Одним из аспектов решения общей проблемы восстановления почв является биологическая очистка нефтезагрязненных территорий с использованием жизнедеятельности углеводородокисляющих микроорганизмов. Большой популярностью пользуются биопрепараты,предлагаемые различными компаниями Европы, США, России и др. Однако,как свидетельствует практика,применение биопрепаратов российского и зарубежного производства на территории казахстанских нефтяных месторождений, расположенных в климатической зоне с высокой температурой и малым количеством осадков оказывается малоэффективными. 2 В таких климатических условиях процессы самоочищения и восстановления почв проходит крайне медленно. Поэтому наиболее актуальным становится применение для биоремедиации почв биологических препаратов, полученных на основе аборигенных штаммов микроорганизмов. Биоден сухой - нефтеокисляющий препарат,полученный в процессе биосинтеза из консорциума бактериальных штаммов глубинным культивированием с последующим концентрированием, сушкой и стандартизацией готового препарата минеральными солями, рыбной мукой и кормовыми дрожжами. Самыми известными и давно применяющимися на практике из нефтеокисляющих препаратов являются биопрепараты Путидойл и Деворойл. Известно, что препарат Путидойл состоит из одного штамма бактерии 36 (А.с.1076446, 1982, А. с.1428809, 1988). Препарат получают глубинным культивированием бактерии в питательной среде при 30 С, в аэробных условиях, с последующей распылительной сушкой, либо лиофилизацией полученной культуральной жидкости. Поскольку препарат Путидойл является монокультурой, он обладает меньшим потенциалом и более узким спектром действия на углеводороды,чем препараты, состоящие из двух и более штаммов микроорганизмов, например Деворойл (патент РФ 2023686). Известно, что в состав препарата Деворойл входят штаммы, ,, .,, (ранее.). В соответствии с патентом, Деворойл также получают глубинным культивированием в питательной среде входящих в его состав микроорганизмов и последующим высушиванием полученной биомассы. Однако Деворойл состоит из микроорганизмов различной таксономической и видовой принадлежности, требующих раздельного выращивания, что существенно усложняет и удорожает процесс наработки препарата. С другой стороны,при совместном культивировании микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам и различающимся по скорости роста, субстратной специфичности,температурному оптимуму роста и пр., возникает конкурентная борьба за источники питания, и в результате в таком препарате выживают не все виды из заявленных,и,соответственно,уменьшается эффективность такого препарата. Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения бактериального препарата Родер для очистки почв, почвогрунтов,нефтешламов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ 2295403). Способ получения препарата осуществляется следующим образом 1. Лиофилизированные культуры-1514 и штаммов- 1513 готовят к рассеву,2. Проводят культивирование путем наращивания биомассы штаммов в начале раздельно,затем на последней стадии осуществляется их совместное культивирование в общем ферментере на подобранной питательной среде, которая в качестве единственного источника углерода содержит глюкозу. При этом процесс ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника азота и других органических веществ дрожжевой автолизат или рыбный гидролизах 3. Проводят концентрирование и стабилизацию биомассы,4. Проводят необязательное высушивание. Недостатками этого способа являютсяраздельное культивирование на первом этапе наращивания биомассы, что вызывает увеличение времени культивированияиспользование в качестве одного из компонентов питательной среды автолизатов и гидролизатов, что значительно удорожает стоимость препарата. Целью изобретения является уменьшение времени культивирования консорциума микроорганизмов с заменой ферментационной среды на новую питательную среду из отечественного сырья с сохранением активности препарата Биоден на пилотной установке филиала НЦБ РК МОН РК в г. Степногорск. Техническим результатом настоящего изобретения является оптимальная схема получения биопрепарата нефтедестуктора, которая позволяет получить максимальный выход при минимальной себестоимости препарата, на основе аборигенных активных штаммов УОМ,характерных и специфичных для нефтедобывающих регионов Казахстана, с учетом почвенно-климатиче ских о собенно стей. На биотехнологическом рынке Казахстана отсутствует производство высокоактивных нефтеокисляющих препаратов. Препараты,ввозимые из ближнего и дальнего зарубежья малоэффективны,так как являются неспецифичными для конкретного региона. В качестве основных продуцентов биопрепаратов предполагается использовать 4 новых аборигенных штамма бактерий, обладающих высокой способностью деградировать нефть. Характеристика штамма 69. Штамм 69 выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Культура 69 грамположительный облигатный аэроб. Кокки,расположенные попарно. При росте на плотной питательной среде колонии округлые, края ровные,выпуклые, размер колоний 1,0-3,0 мкм, поверхность гладкая, блестящая, консистенция пастообразная, от светло-оранжевого до ярко оранжевого цвета,пигмент в среду не выделяет. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки. Использует маннит, арабинозу с образованием кислоты. Крахмал не гидролизует, желатину не разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает 3 положительную реакцию на катал азу и отрицательную на оксидазу. Обладает уреазной активностью. Растет на СПБ с добавлением 7 хлорида натрия. Растет при температуре 15 С 37 С,оптимум температуры роста 2530 С. Хранят на скошенной агаризованной среде Ворошиловой-Диановой с добавлением 1 сырой нефти или отдельных углеводородов при температуре 4 С. Пересев один раз в три месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм 69 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером 0181. Характеристика штамма Кл 1,представляет собой короткие палочки,расположенные попарно, при росте на плотной среде колонии округлой формы, края ровные,выпуклые, размер колоний 3,0 мм, поверхность гладкая, блестящая, структура однородная. На вторые сутки колонии бежевого цвета, пигмент в среду не выделяет. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки. В качестве источника углерода использует глюкозу. Хранят на скошенной агаризованной среде Ворошиловой-Диановой с добавлением 1 сырой нефти или отдельных углеводородов при температуре 4 С. Пересев один раз в три месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм Кл 1 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером - 0264. Характеристика штаммаУД 6-4. ШтаммУД 6-4 выделен из образцов нефтезагрязненной почвы Атырауской области. КультураУД 6-4 грамположительный аэроб. Кокки, расположенные попарно. При росте на плотной питательной среде колонии округлые, края ровные, выпуклые, размер колоний 1,0-3,0 мкм, поверхность гладкая,блестящая, структура однородная. Спор не образует. На вторые сутки колонии светло-розового цвета,на третьи-четвертые сутки - колонии красного цвета, пигмент в среду не выделяет. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки. Крахмал не гидролизует,желатину не разжижает. Сероводород образует, индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Обладает уреазной активностью. Растет на СПБ с добавлением 7 хлорида натрия. Растет при температуре 10 С 37 С,оптимум температуры роста 2530 С. Хранят на скошенной агаризованной среде Ворошиловой-Диановой с добавлением 1 сырой нефти или отдельных углеводородов при температуре 4 С. Пересев один раз в три месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. ШтаммУД 6-4 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером 0180. Характеристика штамма. 3. Культура. 3 представляет собой грамположительный хемоорганотроф, аэроб, при росте на плотной среде СПА через 72-96 часа колонии округлой формы, размером 2-3 мм,красного цвета, слегка приподнятые, блестящие,поверхность гладкая, пастообразной консистенции с ровными краями. Полиморфные, кокки-палочкикокки, палочки размером 2-3 мкм с округленными концами, расположенные одиночно и в скоплениях. Штамм не токсичен и не патогенен. Хемоорганотроф, аэроб,образует щелочь из глюкозы, мальтозы сахарозы, лактозы, маннита. Каталаза положительная, оксидаза отрицательная,уреаза отрицательная. Разжижжает желатин, не гидролизует крахмал,не восстанавливает нитрат, не образует индол,сероводород и ацетилметилкарбинол,не дезаминирует фенилаланин. Растет при температуре 45 С 15 С, оптимум температуры роста 30 С. Хранят на скошенной агаризованной среде Ворошиловой-Диановой с добавлением 1 сырой нефти или отдельных углеводородов при температуре 4 С. Пересев один раз в три месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм. 3 депонирован в коллекции микроорганизмов РКМ под номером - 0290. Способ осуществляется следующим образом Для глубинного выращивания используют посевные и ферментационные среды. В качестве посевной и ферментационной используют среду- 0,02 вода водопроводная до 1 л.-7,3-7,4 В инокулятор засевают маточную культуру,полученную при культивировании на качалке. Через 20-24 часа эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. Культивирование заканчивается к 20-25 часам роста. Окончание роцесса культивирования определяют микроскопированием мазка культуры 4 в поле зрения должно быть не менее 2 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости. Культура должна быть подвижной. Концентрирование полученной культуральной жидкости проводят сепарированием или центрифугированием. Концентрат высушивают на распылительной сушилке. Затем проводят стандартизацию препарата наполнителем минеральными солями, рыбной мукой и кормовыми дрожжами. Получают сухой порошок. Состав сухого порошка концентрат углеводородокисляющих микроорганизмов с остатками питательной среды-1-10,- Аммоний азотнокислый или мочевина 10,0- Калий фосфорнокислый однозамещенный (или двузамещенный) 10,0- Кормовые дрожжи до 100 Существенным отличительным признаком предлагаемого способа от прототипа является использование не гидролизатов и автолизатов, а рыбной муки и кормовых дрожжей, и использование совместного культивирования всех четырех штаммов при получении посевного материала и получении биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов, что позволяет сократить время культивирования как минимум в четыре раза. Прим ер 1. Стерильную среду РПА разливают в стерильные пробирки, диаметром 16 мм, по 7-8 мл и скашивают. Производят засев суспензией, полученной в результате смыва культуры с косяка высокопродуктивного варианта стерильным физраствором или стерильной дистиллированной водой. Инкубируют в термостате при температуре(301 С) в течение 72-96 часов до образования на поверхности агара колоний культуры в виде обильного светло-кремового, слизистого налета. Каждую культуру культивируют отдельно. Рабочие партии углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях стерильного микробиологического бокса пересевают со скошенного агара в колбы Эйленмейера объемом 0,75 л со стерильной средой в объеме 0,1 л для наработки посевного материала. Культивирование проводят на качалке при температуре (301)С и частоте вращения (23010) об/мин в течение (242) ч. Доза посевного материала составляет 5-8 от объема среды в ферментере. Каждую культуру культивируют отдельно на среде ВДМК, следующего состава В качестве ферментационной среды применяют среду следующего состава, г/л аммоний азотнокислый- 0,02 вода водопроводная до 1 л.- 7,3 - 7,4 Посевной материал (маточную культуру) углеводородокисляющих микроорганизмов с титром 11 миллиардов колониеобразующих единиц в мл,объемом 400 мл, выращенный в колбах, объединяют и асептически переносят в стерильный аппарат Боброва. В подготовленный стерильный инокулятор,соблюдая правила асептики, закачивают при помощи сжатого воздуха стерильную среду ВДМК в объеме 3,8 л и проводят засев аппарата материалом. Устанавливают следующий режим культивирования температура - (301)С давление в аппарате - (0,02-0,03) МПа количество оборотов мешалки - (50020) мин-1 расход воздуха - 1,0 л/мин/1 л среды до 4 часов роста- 1,3-1,4 л/мин /1 л среды с 4 часов роста К 24 часу роста заканчивается процесс накопления биомассы. Титр жизнеспособных клеток определяют методом Пастера - Коха - 210 миллиардов колониеобразующих единиц в мл. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной среды применяют среду ВДМК. Биосинтез консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов в ферментере проходит 25 часов при том же режиме культивирования. Титр жизнеспособных клеток - 13 миллиардов колониеобразующих единиц в мл,Культуральную жидкость передают на стадию концентрирования. Концентрирование проводят на центрифуге. Пасту с титром жизнеспособных клеток ПО миллиардов колониеобразующих единиц в г после центрифугирования передают на распылительную сушку. Перед сушкой в пасту добавляют 5 -10 натрия хлористого. Сушат при температуре на входе в сушилку (135 - 140) С и на выходе из сушилки(70-75)С. Титр жизнеспособных клеток 180 миллиардов колониеобразующих единиц в г. Сухой порошок стандартизируют минеральными солями, рыбной мукой и кормовыми дрожжами до титра жизнеспособных клеток 20 миллиардов колониеобразующих единиц. Проведенные опыты по деструкции 10 нефти в водной среде при норме расхода препарата 0,001 г на 10 г нефти показали деструкцию на 76 без предварительного оживления микроорганизмов. Опыты проводились на термостатируемой качалке в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при температуре 30 С и скорости вращения ротора качалки (23010) оборотов в минуту в течение 21 суток. 5 Пример 2. Стерильную среду РПА разливают в стерильные пробирки, диаметром 16 мм, по 7-8 мл и скашивают. Производят засев суспензией, полученной в результате смыва культуры с косяка высокопродуктивного варианта стерильным физраствором или стерильной дистиллированной водой. Инкубируют в термостате при температуре(301 С) в течение 72-96 часов до образования на поверхности агара колоний культуры в виде обильного светло-кремового, слизистого налета. Каждую культуру культивируют отдельно. Рабочие партии углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях стерильного микробиологического бокса пересевают со скошенного агара в колбы Эйленмейера объемом 0,75 л со стерильной средой в объеме 0,1 л для наработки посевного материала. Культивирование проводят на качалке при температуре (301)С и частоте вращения (23010) об/мин в течение (242) ч. Доза посевного материала составляет 5-8 от объема среды в ферментере. Каждую культуру культивируют отдельно на среде ВДМК, следующего состава В качестве ферментационной среды применяют среду следующего состава, г/л аммоний азотнокислый- 0,02 вода водопроводная до 1 л.- 7,3 - 7,4 Посевной материал (маточную культуру) углеводородокисляющих микроорганизмов с титром 11 миллиардов колониеобразующих единиц в мл,объемом 400 мл, выращенный в колбах, объединяют и асептически переносят в стерильный аппарат Боброва. В подготовленный стерильный инокулятор,соблюдая правила асептики, закачивают при помощи сжатого воздуха стерильную среду ВДМК в объеме 3,8 л и проводят засев аппарата материалом. Устанавливают следующий режим культивированиятемпература - (301)С давление в аппарате - (0,02-0,03) МПа количество оборотов мешалки - (50020) мин-1 расход воздуха - 1,0 л/мин/1 л среды до 4 часов роста- 1,3-1,4 л/мин /1 л среды с 4 часов роста К 23 часу роста заканчивается процесс накопления биомассы. Титр жизнеспособных клеток определяют методом Пастера - Коха - 210 колониеобразующих единиц в мл. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной среды применяют среду ВДМК. Биосинтез консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов в ферментере проходит 22 часа при том же режиме культивирования. Титр жизнеспособных клеток - 13 миллиардов колониеобразующих единиц в мл,Культуральную жидкость передают на стадию концентрирования. Концентрирование проводят на центрифуге. Пасту с титром жизнеспособных клеток ПО миллиардов колониеобразующих единиц в г после центрифугирования передают на распылительную сушку. Перед сушкой в пасту добавляют 5 -10 натрия хлористого. Сушат при температуре на входе (135 - 140) С и на выходе (7075)С. Титр жизнеспособных клеток в г составил 100 миллиардов колониеобразующих единиц. Сухой порошок стандартизируют минеральными солями, рыбной мукой и кормовыми дрожжами до титра жизнеспособных клеток 20 миллиардов колониеобразующих единиц. Проведенные опыты по деструкции 10 нефти в водной среде при норме расхода препарата 0,001 г на 10 г нефти показали деструкцию на 55 без предварительного оживления микроорганизмов. Опыты проводились на термостатируемой качалке в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при температуре 30 С и скорости вращения ротора качалки (23010) оборотов в минуту в течение 21 суток. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения препарата деградирующего нефть путем глубинного культивирования консорциума микроорганизмов разных видов в условиях аэрации на питательной среде,концентрирования полученной культуральной жидкости центрифугированием и распылительной сушкой, отличающийся тем, что в состав питательной среды входят рыбная мука и кормовые дрожжи, используются совместное культивирование всех четырех штаммов при получении посевного материала и получении биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов, а для накопления биомассы используют аборигенные штаммы бактерий 69,Кл 1,УД 6-4,. 3.