Способ получения пастообразного препарата азотфиксирующих бактерий

(51) 05 11/08 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ культивирования в ферментерах,центрифугирования с получением концентрата клеток азотфиксирующих бактерий и добавления в биомассу наполнителя для стандартизации,отличающийся тем, что перед центрифугированием биомассу осаждают бентонитом, надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют с получением концентрата клеток азотфиксирующих бактерий в виде пасты, которую стандартизируют бентонитом. Технический результат. Получение пастообразного препарата предлагаемым способом позволяет увеличить содержание в нем жизнеспособных клеток, повысить выход готового препарата и срок его хранения, что в конечном итоге повышает эффективность производства пастообразного препарата.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Айткельдиева Светлана Айткельдиновна Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Шорабаев Ерик Жарылкасынович(56) Предварительный патент РК 17633, кл. 05 11/08, 2006(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАСТООБРАЗНОГО ПРЕПАРАТА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способам получения препаратов азотфиксирующих бактерий. Способ получения пастообразного препарата азотфиксирующих бактерий путем выращивания посевного материала в питательной среде в колбах на качалке,в инокуляторах,глубинного 23470 Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способам получения препаратов азотфиксирующих бактерий. Известен способ получения пастообразного препарата из клубеньковых бактерий. Согласно этому способу, бактерии культивируют в колбах,инокуляторе, ферментере на питательной среде следующего составакукурузный экстракт - 0,6 глюкоза-1,0- 0,02 К 2 НРО 4 - 0,05 (4)24 0,05 472 - 0,02 вода питьевая - остальное рН среды - 6,85. После культивирования в ферментере в течение 24-25 ч производят центрифугирование культуральной жидкости при 3000 об/мин, в течение 60 мин. Выход биомассы азотфиксирующих бактерий с 85 л жидкой культуры составляет 0,5-0,6 кг (6-7 г/л) с влажностью 80-85 и титром не менее 250 млрд кл/г. В биомассу азотфиксирующих бактерий добавляют готовый 50-ный глинистый раствор каолина (каолинсупернатант в соотношении 11) и перемешивают на механический мешалке в течение 3 ч. Титр клеток в готовом продукте составляет не менее 6,0 млрд клеток/г. Расчетный выход препарата с 85 л жидкой культуры составляет 165-170 кг или 1,9-2,0 кг с 1 л. Готовый препарат азотфиксирующих бактерий фасуют в пластиковые бутыли и хранят при температуре 4 С не более 14 суток (Предпатент РК 17633 кл. 05 11/08, 2006). Недостатком этого способа является недостаточно высокий титр бактерий в жидкой культуре и короткий срок хранения готового препарата. Задачей изобретения является повышение содержания бактериальных клеток в препарате и увеличение срока хранения готового продукта. Технический результат - повышение выхода готового препарата, увеличение содержания в нем жизнеспособных клеток и срока хранения достигается тем, что перед центрифугированием биомассу осаждают бентонитом, надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют с получением концентрата клеток азотфиксирующих бактерий в виде пасты, которую стандартизируют бентонитом. Способ получения пастообразного препарата заключается в следующем. Выращивают посевной материал в колбах на качалке при 180-200 об./мин, температуре 25-28 С в течение 22-24 ч на питательной среде следующего состава,кукурузный экстракт - 0,6 глюкоза - 1,0- 0,02 К 2 НРО 4 - 0,05 (4)24 - 0,05 472 - 0,02 дрожжевой экстракт - 0,3 вода питьевая - остальное, рН среды - 6,8-6,9. Титр клеток в конце ферментации составляет не менее 20 млрд КОЕ/мл. Посевной материал, полученный в колбах,используют для засева вышеописанной питательной среды в инокуляторе или ферментере в количестве 5. Питательную среду готовят в инокуляторе и ферментере и стерилизуют при 121 С в течение 30 минут. Режим культивирования в инокуляторе и ферментере 2 Температура культивирования 25-28 С Обороты мешалки 300-400 об./мин Расход технологического воздуха 0,6 /мин. Время культивирования 22-25 часов Титр клеток в конце ферментации не ниже 20 млрд КОЕ/мл. В культуральную жидкость, полученную после ферментации, добавляют 3 растворенного в питьевой воде бентонита,смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. За это время биомасса адсорбируется на бентоните и осаждается. Надосадочную жидкость,составляющую 2/3 всего объема, декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 об./мин в течение 30 мин. При этом получают биомассу бактерий,адсорбированную на бентоните, в количестве 40-50 г/л с титром не менее 11012. В надосадочную жидкость добавляют бентонит (соотношение бентонита и жидкости 11), хорошо перемешивают и оставляют на 1,5-2 ч для набухания бентонита. В подготовленный таким образом бентонит добавляют расчетное количество биомассы азотфиксирующих бактерий для получения титра готового продукта не менее 10 х 109 КОЕ/мл и перемешивают на механической мешалке. Выход пастообразного препарата с влажностью 49,5 составляет 5-6 кг/л. Препарат фасуют по 200, 400 или 800 г в полиэтиленовые мешки, удаляют воздух и запаивают. Срок хранения препарата при температуре 4-8 С 3 месяца со дня изготовления. Пример 1. Выращивание культуры азотфиксирующих бактерий производят на питательной среде следующего состава,Кукурузный экстракт- 6,8-6,9 Посевной материал азотфиксирующих бактерий-17 выращивают в колбах вместимостью 750 мл, содержащих 250 мл питательной среды, на качалке при 200 об./мин в течение 24 ч при температуре 28 С. В конце ферментации культуральную жидкость микроскопируют,определяют оптическую плотность. Наработку культуральной жидкости азотфиксирующих бактерий производят в ферментере вместимостью 30 л с мешалкой. Питательную среду выше указанного состава готовят в ферментере и стерилизуют при 121 С в течение 30 минут. После охлаждения питательной среды до 28 С ее засевают пятью процентами посевного материала. Культивирование производят при следующем режиме Температура культивирования 28 С Обороты мешалки 300-400 об./мин Расход технологического воздуха 0,6 /мин. 23470 Время культивирования 25 часов Титр клеток в культуральной жидкости 50 млрд КОЕ/мл. В культуральную жидкость добавляют 3 растворенного в питьевой воде бентонита, смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. Затем надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. При этом получают биомассу бактерий, адсорбированную на бентоните,в количестве 1,5 кг (50 г/л) с титром 31012. В надосадочную жидкость добавляют бентонит(соотношение бентонита и жидкости 11) и оставляют на 2 ч для набухания бентонита. В подготовленный таким образом бентонит добавляют расчетное количество биомассы азотфиксирующих бактерий и перемешивают на механической мешалке. Выход пастообразного препарата с влажностью 49,5 составляет 180 кг (6 кг/л) с титром 15109 КОЕ/г. Препарат фасуют по 200 г в полиэтиленовые мешки, удаляют воздух и запаивают. Через 3 месяца хранения препарата при температуре 4-8 С содержание в нем жизнеспособных клеток составляет 10109 КОЕ/г. Пример 2 Наработку культуральной жидкости азотфиксирующих бактерийД-3 производят аналогично примеру 1. Титр клеток в культуральной жидкости составляет 49 млрд КОЕ/мл. В культуральную жидкость добавляют 3 растворенного в питьевой воде бентонита, смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. Затем надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. При этом получают биомассу бактерий, адсорбированную на бентоните,в количестве 1,35 кг (45 г/л) с титром 51012. В надосадочную жидкость добавляют бентонит(соотношение бентонита и жидкости 11) и оставляют на 2 ч для набухания бентонита. В подготовленный таким образом бентонит добавляют расчетное количество биомассы азотфиксирующих бактерий и перемешивают на механической мешалке. Выход пастообразного препарата с влажностью 49,5 составляет 165 кг (5,5 кг/л) с титром 18109 КОЕ/г. Препарат фасуют по 200 г в полиэтиленовые мешки, удаляют воздух и запаивают. Через 3 месяца хранения препарата при температуре 4-8 С содержание в нем жизнеспособных клеток составляет 12 х 109 КОЕ/г. Получение пастообразного препарата предложенным способом имеет ряд преимуществ по сравнению с прототипом. Во- первых, введение в состав питательной среды дрожжевого экстракта для выращивания азотфиксирующих бактерий позволяет получить титр бактериальных клеток в конце ферментации не ниже 20 млрд КОЕ/мл по сравнению с 4,5 млрд КОЕ/мл в прототипе. Это способствует повышению выхода готового продукта. Во-вторых, осаждение биомассы бентонитом перед центрифугированием позволяет на треть снизить объем культуральной жидкости,подлежащей центрифугированию и снизить потери бактериальных клеток при центрифугировании. В-третьих, использование бентонита вместо каолина для стандартизации биомассы позволяет получить пастообразный препарат с влажностью 49,5 со сроком хранения 3 месяца. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения пастообразного препарата азотфиксирующих бактерий, путем выращивания посевного материала в питательной среде в колбах на качалке,в инокуляторах,глубинного культивирования в ферментерах,центрифугирования с получением концентрата клеток азотфиксирующих бактерий и добавления в биомассу наполнителя для стандартизации,отличающийся тем,что перед центрифугированием биомассу осаждают бентонитом, надосадочную жидкость декантируют,а осадок центрифугируют с получением концентрата клеток азотфиксирующих бактерий в виде пасты, которую стандартизируют бентонитом.