Питательная среда для культивирования энтомопатогенных бактерий обладающих инсектицидной и акарицидной активностью

(51) 01 63/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Сущность изобретения состоит в том, что для выращивания энтомопатогенных бактерий.шт. 620 и увеличения содержания-экзотоксина используются питательные среды, в которых в отличие от лабораторной паспортной среды ДПС оптимизирован компонентный состав и дополнительно введены новые ингредиенты кормовые дрожжи, соевая и кукурузная мука и минеральные соли. Концентрацию экзотоксина определяют в культуральной жидкости культур спектрофотометрически путем осаждения экзотоксина солями Са-Ва, после удаления солей ионообменными смолами при длине волны 260 нм Данилова Э.Б. Барбашова Н.М. Спектрофотометрическое определение бета- экзотоксина в культуральной жидкости. Тр. ВНИИ с-х микробиологии, 1985, т.55, с.115-11807.00.01117-2010 Метод определения содержания экзотоксина в препарате Битокситурин и других препаратах на основе МВИ 30135217-01-2009 методом анионообменной хроматографии Бубенщикова С.Н., Каграманова В.Г.,Баратова , Данилова Э.Б., Кругляк Е. Б. Определение экзотоксина методом высокоэффективной хроматографии. Химия природных соединений, 1982, 3, 389-392. При использовании усовершенствованной питательной среды выход целевого продукта (экзотоксина) увеличивается на 82,0 по сравнении с паспортными данными на штамм.(72) Талжанов Нургазы Айтказыевич Балпанов Дархан Серикович Некрасова Нина Ивановна Чарыкова Ирина Владимировна(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ОБЛАДАЮЩИХ ИНСЕКТИЦИДНОЙ И АКАРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии,а именно к производству бактериальных биопрепаратов, предназначенных для борьбы с вредителями зерновых культур при хранении,являющихся представителями отрядов и др. Эффективная борьба с вредителями играет важную роль в сохранении и увеличении урожая,поскольку без проведения защитных мероприятий потеря только урожая зерна от вредных насекомых может составить от 25 до 40. Задача заявляемого изобретения - оптимизация питательной среды для культивирования штамма.ш. 620,являющегося основой биопрепарата БиоКенБид БМП, КС обладающего как инсектицидной, так и акарицидной активностью в отношении насекомых вредителей зерновых культур при хранении. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано в производстве энтомопатогенных препаратов для борьбы с вредителями зерновых культур при хранении, являющихся представителями отрядов при глубинном культивировании проводят обычно на сложных средах, в состав которых обязательно входят источники углеродного и азотного питания это могут быть дрожжи БВК, кукурузный экстракт,отходы пивоваренного производства, дрожжевой экстракт, меласса, гидролизат казеина, а также минеральные соли и регуляторы роста. Наиболее близким к предлагаемому способу является культивирование.98 выделяющий экзотоксин в сравнительно невысокой концентрации 500 600 мкг/мл на среде ДПС содержащей в качестве источника азотного питания дрожжи БВК и углеродного - кукурузную муку А.с. 1074138 (1982) Скворцова М.И., Шашкина Н.И., Мурзинцева Н.Б.,Повлек , Пахтуев А.И., Кандыбин Н.В.,Барбашова Н.М., Скворцов Г.Е., Чегодаев Ф. Н.,Штамм.98 продуцент битоксибациллина. К недостаткам способа прототипа следует отнести то, что значительная часть конечного продукта, получаемого на среде ДПС, состоит из неутилизированных компонентов питательных субстратов (50-60)и клеточных остатков. Это затрудняет контроль процесса ферментации, а также не позволяет получить конечный продукт в чистом виде. Существенным недостатком этого штамма является чувствительность к фагам Королева Ю. В.,Григорьева Т.М. Азизбекян Выделение и характеристика фагоустойчивых мутантов. . Биотехнология,1992,23-5. Вторым недостатком способа прототипа является то, что его цель заключается в повышении выхода спор. Однако из литературных источников известно,что вклад спор в основную характеристику культуральной жидкости и готовых продуктов на основенезначителен и не превышает 3. Очевидно, что для увеличения эффективности процессов культивирования этих продуцентов,средств защиты растений, необходимо направлять усилия в первую очередь на оптимизацию процессов продуцирования в культуральную жидкость экзотоксина в более высокой концентрации и эндотоксина с активностью не ниже паспортных показателей. Но, в этом случае,подходы к оптимизации отличаются от подходов,примененных в способе прототипе. Третьим недостатком способа прототипа является то, что производство дрожжей БВК прекращено по экологическим причинам, т.к. их нарабатывали на основе н-парафинов нефти дрожжами вида, биомасса которых оказывает аллергизирующее, иммуномодулирующее и иное действие на человека и животных. 2 Предлагаемый способ устраняет выше отмеченные недостатки способа прототипа. Целью предлагаемого способа является разработка прописи продуктивной питательной среды для культивирования штаммовна основе оптимального подбора питательных субстратов,позволяющей достигнуть максимального экзотоксинобразования культуральной жидкости, сохранения уровня спорообразования и снижения термостабильности спор. Задачей изобретения является поиск новых недефицитных,эффективных субстратов и оптимизация питательной среды по источнику углеродного и азотного питания. Технический результат заявленного изобретения состоит в получении питательной среды для культивирования бактерий.шт. 620 не уступающей по экзотоксинообразованию и продуктивности питательной среде ДПС. Существо предложенного способа заключается в следующем. Размножение шт. 620 при периодическом культивировании проводится на питательной среде ДПС. В состав этой питательной среды обязательно входят источники углеродного и азотного питания это дрожжи БВК и кукурузная мука,соответственно. Углерод служит первичным сырьем для синтеза нового клеточного материала или вырабатываемых клетками продуктов. Рост и развитие культурызависит от содержания в среде углеводов,оптимальным является 1,0-1,5,увеличение количества углеводов ухудшает кристаллообразование, а снижение уменьшает концентрацию клеток. Динамика потребления азотистых компонентов характеризуется двухфазностью развития популяции вегетативным ростом и кристаллообразованием. В первой фазе происходит активное потребление этих ингредиентов с момента начала активного роста популяции до стадии кристаллообразования. Во второй фазе наблюдается некоторое накопление азотистых продуктов в связи с их поступлением в среду в результате разрушения клеточных стенок. Для роста шт. 620 необходимы также минеральные соли. Так, при добавлении в питательную среду ионов кальция и марганца повышается степень патогенности. При разработке питательной среды для культивирования.шт. 620 стояла задача по замене дрожжей БВК. В качестве источника углеродного питания выбрана кукурузная мука, содержание которой в питательных средах колебалось в пределах 1,0-1,5. В состав сред введены также необходимые для роста микроорганизмов минеральные соли. Культуру.шт. 620 выращивали при (301) в качалочных колбах объемом 250 мл с рабочим объемом 15 мл при 240-260 об/мин на питательных средах разного состава. Для засева питательной среды использовали посевной материал (2 по объему),полученный при помощи смыва спор культуры со скошенной агаризованной среды СПА 1,5. Культивирование вели до появления в культуре не менее 95 свободных спор. Для глубинного культивирования.шт. 620 разработано 4 варианта питательных сред на основе кормовых дрожжей и кукурузной муки. Оценку питательных сред проводили по двум основным параметрам, а именно титру спор и концентрации основного действующего вещества -экзотоксина в сравнении с паспортными данными и показателями культивирования на питательной среде ДПС. Пример 1. Питательная среда КДПС следующего состава- 1,5 кальций хлористый - 0,15 вода водопроводная до 100. Экспериментально установлено, что питательная среда КДПС по экзотоксинообразованию на 14,0 выше, чем на контрольной среде ДПС, а по титру спор превышает в среднем на 8,0 . Пример 2 Питательная среда КДПСМ - 4, где в качестве фактора роста введены минеральные соли, в составе- 1,5 калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5 магний сернокислый - 0,01 марганец сернокислый 0,02 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,2 кальций хлористый - 0,15 вода водопроводная до 100. При применении предлагаемой питательной среды КДПСМ-4 по сравнению с базовой питательной средой ДПС содержание -экзотоксина увеличилось на 36,2 . Пример 3 В питательной среде КДПСМ-5 уменьшено содержание кукурузной муки до 1,0. При культивировании на данной питательной среде наблюдалось снижение титра жизнеспособных спор,а содержание -экзотоксина увеличилось на 36,4. Пример 4 В питательной среде КДПСМ-6 вместо кукурузной муки в качестве углеводного питания введен крахмал картофельный в концентрации 1,0. При культивировании на питательной среде КДПСМ-6 экзотоксинообразование на 41,0 превосходит показатели на питательной среде ДПС и на 82,0 паспортные данные на штамм. Более подробно предлагаемый способ и его эффективность демонстрируются результатами опытов,представленных ниже. Результаты испытаний представлены ниже. Возможность и эффективность предлагаемого способа демонстрируется следующими примерами(таблица 1). Таблица 1 Состав питательных сред для культивирования, продуктивность, экзотоксинобразование культуры.ш. 620 Компоненты питательных сред,Дрожжи БВК Кормовые дрожжи Кукурузная мука Крахмал картофельный К 2 НРО 4 КН 2 РО 4 Пример 1. В предлагаемом способе культивирования на питательной среде КДПС содержание -экзотоксина- 752,0 мкг/мл кж, что на 14,0 выше, чем в контрольной среде ДПС-646,0 мкг/мл кж и на 73,4 выше паспортных данных на штамм. По жизнеспособности титра спор превышает контроль ДПС в среднем на 8,0. Пример 2. При культивировании на питательной среде КДПСМ-4 содержание -экзотоксина - 964,0 мкг/мл кж, что на 36,2 выше, чем в питательной среде ДПС и на 79,3 выше паспортных данных на штамм. Пример 3. При культивировании на питательной среде КДПСМ-5 содержание -экзотоксина-989,0 мкг/мл кж, что на 36,4 выше, чем на питательной среде ДПС и на 79,8 превосходит паспортные данные на штамм. Пример 4. Применение для культивирования питательной среды КДПСМ-6 показало содержание экзотоксина-1098,0 мкг/мл кж, что на 32,0 выше,чем на питательной среде КДПС, на 41,0 превосходит показатели на питательной среде ДПС и на 82,0 паспортные данные на штамм. Таким образом,способ культивирования энтомопатогенной бактерии.ш. 620 на питательной среде КДПСМ-6,содержащей кормовые дрожжи,кукурузную муку, крахмал картофельный и минеральные соли на 41,0 по экзотоксинообразованию превышает показатели на питательной среде ДПС и в 82,0 паспортные данные штамма-продуцента, что обеспечивает высокую инсектицидную активность. Полученные на питательной среде КДПСМ-6 образцы биомассы прошли испытание на биологическую эффективность в отношении амбарного клеща в ТОО Казахский научноисследовательский институт переработки сельскохозяйственной продукции(г.Астана). Результаты проверки биологической эффективности опытного образца биомассы показали, что уже на 4-е сутки наступает массовая гибель насекомых даже при самой низкой концентрации препарата - 0,5 по сравнению с контролем, где наблюдалось 100-ное выживание насекомых. На основе полученной биомассы разработана товарная готовая форма и наработана опытная партия биопрепарата БиоКенБид-БМП, КС. В результате производственных испытаний биопрепарата в ТОО Ак Дэн, Акмолинской области против вредителей запасов (амбарный долгоносик, мучной клещ, малый мучной хрущак и зерновой точильщик) установлена высокая биологическая эффективность-100 при обработке незагруженного складского помещения и при обработке зерна фуражного, продовольственного и семенного насыпью до 2,5 м - (94,0-98,6). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Питательная среда для культивирования энтомопатогенных бактерий,обладающих инсектицидной и акарицидной активностью,включающая дрожжевой экстракт, кукурузную муку, минеральные соли, воду водопроводную,отличающаяся тем, что в состав среды в качестве источника азотного питания вводят кормовые дрожжи, крахмал картофельный - в качестве источника углеродного питания,а также необходимые для роста и экзотоксинообразования микроорганизмов минеральные соли,при следующем содержании компонентов,кормовые дрожжи 2,0 крахмал картофельный 1,0 кукурузная мука 1,5 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5 калий фосфорнокислый двузамещенный 0,5 магний сернокислый 0,01 марганец сернокислый 0,02 аммоний фосфорнокислый двузамещеный 0,2 кальций хлористый 0,15 вода водопроводная остальное