Способ получения микробиологического препарата “Биомикол, суспензионный концентрат” для борьбы с болезнями зерновых культур”

(51) 01 63/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ препарата,являющегося антагонистом по отношению к ряду фитопатогенных грибов. Сущность изобретения бактериивыращивают в условиях глубинного культивирования на жидкой питательной среде,содержащей источники азота,углерода и минеральных солей, полученную таким образом культуральную жидкость вакуум - концентрируют при температуре (5055)С. Далее в полученный суспензионный концентрат добавляют в качестве стабилизатора и консерванта- 1,0 уксусной кислоты в качестве прилипателя и для повышения адгезионных свойств биопрепарата 2,0 Лигногумата. Полученный биопрепарат обладает высокой фунгицидной активностью по отношению к фитопатогенным грибам.(72) Талжанов Нургазы АйтказыевичБалпанов Дархан Серикович Некрасова Нина Ивановна Чарыкова Ирина Владимировна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА БИОМИКОЛ,СУСПЕНЗИОННЫЙ КОНЦЕНТРАТ ДЛЯ БОРЬБЫ С БОЛЕЗНЯМИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой способ получения биологического фунгицидного Задачей изобретения является создание технологичного способа получения бактериального препарата для защиты зерновых культур от фитопатогенных грибов,сочетающего фитозащитную, ростстимулирующую активность,стабильность и высокие адгезионные свойства. Указанная задача решается за счет- использования в качестве основы препарата штамма спорообразующих бактерийИПМ-215, обладающего фунгицидной активностью в отношении возбудителей болезней зерновых культур- выращивание штамма на оптимизированных питательных средах с кормовыми дрожжами и кукурузной мукой - источников углерода и азота с добавлением хлористого кальция, обеспечивающих высокую продуктивность и экономичность процесса применение глубинного способа культивирования, обеспечивающего интенсивный рост, спорообразование культуры и синтез антимикробных метаболитов при длительности культивирования 46-48 ч- проведение режима при непрерывном перемешивании с частотой вращения ротора мешалки 200220 об/мин аэрации с расходом 11,5 л воздуха/1 л среды в минуту и термостатировании (292)С- оптимизацию препаративной формы путем вакуум концентрирования КЖ при температуре(5555)С,обеспечивающего сохранность антагонистической активности культуры и титра жизнеспособных спор- использование Лигногумата в качестве прилипателя для повышения адгезионных свойств препарата и эффективности его действия в агробиоценозах- добавление в качестве консерванта и стабилизатора уксусной кислоты. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Для создания оптимальной питательной среды,состав которой мог бы полностью удовлетворять пищевые потребности культурыи способствовать максимальному накоплению фунгицидной активности подбирали источники углерода и органического азота, которые оказывают существенное влияние на продукцию бактериями ингибиторов роста фитопатогенов. В ходе дальнейшей оптимизации условий синтеза ингибиторов роста фитопатогенов нами было изучено влияние различных источников углерода,азота,энергии на рост и антагонистическую активность штамма-продуцентаИПМ-215 (табл. 1, 2). Таблица 1 Состав питательных сред для культивирования и показатели продуктивности штаммаИПМ-215 Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству биопестицидов на основе живых культур микроорганизмов, и касается способа получения эффективного бактериального препарата для защиты зерновых культур от фитопатогенных грибов фузариозного трахеомикоза ( ) фузариозной корневой гнили ( ), обычной корневой гнили,темно-бурой пятнистости( ). Ежегодно ухудшающаяся экологическая ситуация и фитосанитарная нестабильность требует новых подходов к разработке экологически ориентированных систем защиты растений. Одним из направлений оздоровления и стабилизации сельскохозяйственного производства может стать использование методов биологического контроля фитопатогенов. Эффективность микробных препаратов обусловлена как активностью штамма-антагониста,так и выбором способа его культивирования,созданием оптимальных условий для роста и развития культуры, накопления метаболитов с антимикробным действием. Известен ряд препаратов на основе бактерий родаПатент 1805849, МПК 01 63/00, С 12 1/20, 1993 Патент 2130261, МПК 01 63/00, С 12 1/20//(С 12 1/20, С 12 138),1999, способных эффективно подавлять развитие фитопатогенных грибов и бактерий. Однако они имеют ряд недостатков, главный из которых ограниченный срок жизнедеятельности бактериальных клеток. Установлено, что после обработки семян и последующего высушивания бактерии родагибнут в течение 2-3 дней. Кроме того, для выращивания вышеуказанных микроорганизмов используются богатые дорогостоящие питательные среды - МПБ и среда Кинга В на основе пептона. Известен способ получения бактериального препарата на основе, который включает культивирование бактерий до максимального накопления бактериальных клеток и спор, после чего их подвергают лиофильной сушке Патент 2081167, МПК С 12 1/20//(С 12 1/20,С 12 1125)А 01 63/00, 1997 (аналог). Однако указанный препарат эффективен только в отношении болезней грибной этиологии и не способен контролировать развитие бактериальных фитопатогенных микроорганизмов. Кроме того,недостатком способа является высокая энергоемкость, обусловленная необходимостью лиофильного высушивания культуральной жидкости. Мука кукурузная Картофельный крахмал СаС 2 Таблица 2 Влияние различных источников углерода, азота на антагонистическую активность культурышт. ИПМ-215 варианта среды Диаметр зоны задержки роста тест - культур, мм На основании полученных результатов, а также с целью повышения технико-экономических показателей процесса для культивирования штаммаотобраны питательные среды Ф-1 и Ф-2. Пример 2. Спорообразование культурыИПМ - 215 при росте на разработанных питательных средах (табл. 3, 4). Таблица 3 Динамика роста и спорообразования бактерийИПМ- 215 при выращивании на полупромышленной пилотной установке Длительность культивирования,часов 0 6 12 24 40 Титр спор /мл 109 Наименование питательной среды Ф-1 (с картофельным крахмалом) Ф -2 (с кукурузной мукой) 1,6107 1,9107 8 1,510 1,7108 8 2,610 2,8108 8 5,710 6,2108 9 2,610 2,9109 Таблица 4 Показатели роста и спорообразованияИПМ 215 на питательной среде с кукурузной мукой Наименование показателя Титр, клеток/мл Доля спор,Диаметр зоны подавления роста тест - культуры,ммшт. 169 Согласно представленным в таблицах данным, к 24 ч роста доля спор в популяции составляет около половины от общего количества клеток, а к 40-46 ч процесс спорообразования проходит практически полностью и достигает 96,0-98,0 . Разработанные питательные среды обеспечивают активный рост и спорообразование культурыИПМ 215. Пример 3. Получение биопрепарата в форме суспензионного концентрата и биологическое тестирование оптимизированной товарной формы биопрепарата Биомикол-БМП, СК в отношении культуры. Для получения биопрепарата в форме суспензионного концентрата далее исходную культуральную жидкость концентрировали в 5 раз путем вакуум - выпаривания при температуре 55 С,что обеспечивает максимальную сохранность спор и антимикробных метаболитов. Для стабилизации антагонистической активности и установления 4,5 - 5,0 с целью предотвращения развития посторонней микрофлоры жидкого препарата использовали уксусную кислоту. В качестве наполнителя и прилипателя введен Лигногумат, который повышает адгезионные свойства препарата и эффективность его действия в агробиоценозах, который помимо антистрессовых свойств обладает фунгицидным действием. Культуральная жидкость и образцы готового продукта, наработанные на питательных средах Ф-1 и Ф-2, проверены на антагонистическую активность в отношении культуры(табл. 5). Для эксперимента использована суспензия культурыс плотностью - 0,68 е.о.п.,различные концентрации разведения культуральной жидкости и суспензионного концентрата 1,0 0,5 0,25 и в качестве контроля химический фунгицидный препарат Дерозал в тех же концентрациях. Антагонистическую активность определяли методом диффузии в агар. Таблица 5 Антагонистическая активность в отношении тест - культуры Наименование продукта Культуральная жидкость Готовый продукт Биомикол-БМП, СК Контроль - химический фунгицидный препарат Дерозал Диаметр зоны задержки роста тест- культуры,мм 22,140,81 29,00,01 22,661,56 20,00,75 21,60,33 20,30,53 19,70,36 Установлено, что экологически безопасный биологический препарат Биомикол-БМП, СК характеризуется более высокой эффективностью и эффективностью действия по сравнению с химическим фунгицидным препаратом Дерозал. Пример 4. Для изучения стабильности титра спор и антагонистической активности в процессе хранения готовую товарную форму биопрепарата выдерживали при температурах (205)С и (46)С, периодически отбирая пробы для контроля указанных показателей (табл.6). Таблица 6 Оценка стабильности биопрепарата Биомикол-БМП, СК в процессе хранения(4-6)С 3,190,24 Диаметр зоны задержки роста тест-культуры 20,00,68, мм Установлено,что сохранить титра жизнеспособных спор в препарате через 6 месяцев хранения находится на уровне 90,091,0. При этом антагонистическая активность в конце наблюдаемого периода составляет 93,5 от исходного показателя. Результаты исследования свидетельствуют об эффективности использования введенных 4 наполнителей и стабилизаторов в качестве основы биоинсектицида и перспективности проведения работ, по внедрению разработанной препаративной формы биопестицида Биомикол-БМП, СК в производство. Пример 5. Оценку биологической эффективности биопрепарата проводили в Карабалыкской сельскохозяйственной опытной станции,Костанайской области на посевах яровой пшеницы,сорта Казахстанская раннеспелая и ячменя, сорта Карабалыкская 150 против болезней зерновых культур септориоз, гельминтоспороз, бурая и стеблевая ржавчина. Комплекс мероприятий по защите зерновых от болезней включал следующие варианты контроль без обработок опыт - двукратная обработка биопрепаратом эталон - 100 химическая защита. При этом эффективность биопестицида Биомикол-БМП, СК против болезней зерновых культур составила септориоз и гельминтоспорозная пятнистость листьев - 80, бурая и стеблевая ржавчина - 75. Оценка хозяйственной эффективности проводилась в ТОО Каскеленское ОХ,Алматинской области и установлены следующие результаты по показателю прибавки урожая пшеница - 1,5 ц/га, ячмень - 1,52,0 ц/га. В качестве контроля использовался химический пестицид Агростимулин - эталон показавший прибавку урожая на пшенице 1,9 ц/га и на ячмене 2,4 ц/га. Анализ представленных результатов свидетельствует о том, что предлагаемый способ получения биологического препарата превосходит прототип - биологический препарат Бактофит по ряду показателей, а именно- разработанные питательные среды Ф-1 и Ф-2 обеспечивают активный рост и спорообразование культурыИПМ- 215- широкому спектру антифунгального действия препарата, способного активно подавлять развитие наиболее вредоносных возбудителей болезней зерновых культур - септориоз, гельминтоспороз,бурая и стеблевая ржавчина- высоким адгезивным свойствам и стабильности препарата за счет введения в его состав Лигногумата и уксусной кислоты технологичности использования предлагаемого биопестицида, обусловленная товарной формой препарата в виде суспензионного концентрата,обеспечивающей более длительный срок хранения и возможность транспортировки препарата на большие расстояния. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения микробиологического препарата для борьбы с болезнями зерновых культур, включающий подготовку и выращивание посевного материала, глубинное культивирование продуцентана ферментационной среде, отличающийся тем, что штамм-продуцент культивируют на оптимизированной питательной среде с кормовыми дрожжами и кукурузной мукой с добавлением хлористого кальция получают концентрат бактериальных клеток путем вакуум концентрирования культуральной жидкости при температуре (5055)С, в качестве прилипателя используют Лигногумат и в качестве стабилизатора и консерванта - уксусную кислоту.