Способ получения инсектицидного препарата против чешуекрылых насекомых “Биолепт” в виде сухого порошка

(51) 01 25/12 (2011.01) 01 63/02 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ В качестве посевной и ферментационной среды используют дрожже-полисахаридную среду с добавлением соевой и рыбной муки. В инокулятор засевают посевной материал, полученный смывом со скошенного агара рабочей партии штамма.(3) -07/Б. Культуральную жидкость после свободного высыпания спор и кристаллов (44-48 часов роста) используют в качестве посевного материала при культивировании. Культивирование заканчивают к 24-28 часам роста на стадии полного споро и кристаллообразования культуры. Концентрирование полученной культуральной жидкости проводят сепарированием или центрифугированием. Концентрат высушивают на распылительной сушилке. Затем проводят стандартизацию препарата наполнителем -каолином и получают сухой порошок. Применение препарата в лабораторно - полевых опытах показало 90-98 гибель гусениц чешуекрылых вредителей 3-4 возрастов.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Черемисова Татьяна Геннадьевна Бейсембаева Марал Жусупкызы(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ БИОЛЕПТ В ВИДЕ СУХОГО ПОРОШКА Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии, биотехнологии, к производству бактериальных инсектицидов,предназначенных для борьбы с чешуекрылыми насекомыми. Растениеводческая отрасль Республики Казахстан из-за неблагополучного санитарного состояния посевов ежегодно несет существенные убытки. Воздействие вредных организмов приводит к недобору урожая и снижению качества производимой продукции. Поддержание оптимальных фитосанитарных условий при выращивании сельскохозяйственных культур - залог получения конкурентоспособной растениеводческой продукции. Добиться этого возможно только при соблюдении комплекса мероприятий,включающих химическую и биологическую защиту растений. В настоящее время борьба с вредителями сельскохозяйственных культур в Казахстане базируется исключительно на использовании химических средств защиты растений,что приводит к нарушению экологического равновесия в природной среде и появлению резистентных форм фитофагов. В этой связи актуальной проблемой является разработка биологических мер борьбы с вредными насекомыми, в частности, создание и использование препаратов на основе микроорганизмов естественных антагонистов насекомых. Наибольшее распространение во всем мире получили энтомопатогенные препараты перорального действия,среди которых первостепенное значение приобрели бактериальное биопрепараты на основе. Интерес кс каждым годом возрастает, так как бактерия обладает многими ценными свойствами легко размножается,синхронно спорулирует на многих питательных средах по завершении вегетативного роста образует не только спору, но и параспоральное тело кристаллический эндотоксин -основное оружие поражения насекомых. Споры бактерии легко и устойчиво хранятся при разных условиях. Микроорганизм удобен тем, что выдерживает различные технологические манипуляции сепарацию,вакуум-выпаривание,различные способы сушки, смешивание с наполнителями и др. В высушенном состоянии готовый препарат хорошо хранится в течение года, не теряя своих первоначальных свойств. Все эти качествавыдвинули ее на первое место в арсенале средств защиты растений от вредных насекомых. В мире уже создано около 20 промышленных форм препаратов, в основе которых содержится та или иная разновидность. Только в России таких препаратов разработано более десяти. Внедрение энтомопатогенных микроорганизмов в практику защиты растений обеспечило бы получение экологически чистой сельхозпродукции. Биолепт сухой - инсектицидный препарат,полученный в процессе биосинтеза из.(Н 3 ас) -07 /КБ 2 глубинным культивированием с последующим концентрированием, сушкой и стандартизацией готового препарата каолином. Известен способ получения препарата против чешуекрылых насекомых патент 94037008,кл. 01 63/00, опубл. 27.07.96 г патентообладатель Шевцов В.В. Щелкова Е.В. Жиглецова С.К. Биоинсектицид и способ его получения. Способ культивирования штамма заключается в следующем Для получения эндотоксина готовят питательную среду следующего состава соевой муки-3,0, (4)24-2,0, СаС 2-0,15, засевают ее культурой.штаммом 7 А, культивируют в ферментере, при (302)С и следующем режиме аэрации от 0 до 6 часов расход воздуха 0,5 л/л среды в минуту, от 6 часов до конца ферментации 1,0 л/л среды в минуту,давление 0,5 атмосфер, до 70 высыпания спор,время роста 44-48 часов. В полученную культуральную жидкость добавляли 2 по объему перекиси водорода и выдерживали 1 ч. После чего взвесь центрифугировали до содержания сухих веществ 10. В полученную пасту вносили 30 диаммоний фосфата и 5 смачивателя (неонолов) и 15 сульфидно-дрожжевой бражки, после чего пасту высушивали в распылительной сушилке при температуре (1455)С на входе и (605)С на выходе. Недостатками данного способа являютсяпродолжительное время культивирования использование не сбалансированной питательной среды. На основе получения из культуры.-52. высокопродуктивного штамма серотипа Н 3 а 3 создан инсектицидный препарат -патент 2080065 кл. 01 63/00, опубл. 27.05.1997 патентообладатель Товарищество с ограниченной ответственностью Нива, авторы Орешкин Е.Н. Овсищер М.Р. Азизбекян Бактериальный инсектицид для борьбы с чешуекрылыми. Предлагаемый препарат высокоэффективный биоинсектицид для борьбы с листогрызущими насекомыми вредителями плодовых культур яблонной плодожорки, яблонной и плодовой моли, американской белой бабочки,шелкопряда, листовертки вредителями огородных культур (на капусте, свекле, моркови) -капустной и репной белянок, капустной совки, моли, огневки вредителями лекарственных культур моли,златогузки. Для культивирования продуцента.Н 3 а 3 используют глубинное культивирование на стандартной дрожжеполисахаридной среде на водопроводной воде, следующего состава кормовые дрожжи - 30,0 г/л кукурузная мука 15,0 г/л 6,8- 7,2, посевной материал (1,0). Температура 28 -30 С. Процесс оканчивается, когда 50 -70 клеток завершает.стадию спорообразования, при этом наблюдается выход кристаллов 32 часа. Титр спор в кулыуральной жидкости 3,5 4,0 млрд спор/мл. После окончания культивирования культуральную жидкость сепарируют и далее выделяют биомассу, содержащую споры и кристаллы, концентрируя на распылительной сушке. Для получения препаративной формы инсектицида споро-кристаллический концентрат Вас..с остатками питательной среды смешивают со следующими компонентами сульфонол сульфат аммония пентакалийтрифосфат(или триполифосфат) мел. В зависимости от титра спор в концентрате соотношение концентрат добавки может колебаться, однако спор в препарате должен быть не менее 70 миллиардов спор в грамме. Компонентный состав препарата спорокристаллический комплекс бактерийс остатками питательной среды 35 -65 целевая добавка, содержащая сульфонол (40 массовых частей), сульфат аммония(40 массовых частей), триполифосфат (16 массовых частей) 65 -35. Недостатками данного способа являютсяснижение действующего активного веществанакопительный эффект в почве, воздухе, воде. Целью изобретения является разработка способа получения сухого энтомопатогенного препарата Биолепт сухой, с использованием нового аборигенного инсектицидного штамма на пилотной установке филиала РГПНЦБ РК МОН РК в г. Степногорск. Способ осуществляется следующим образом. Для глубинного выращивания применяют одинаковые посевные и ферментационные среды. Для культивирования используют дрожжеполисахаридную среду с рыбной и соевой мукой(7 А). Состав среды г/л кукурузная мука -15,0 хлорида кальция -1,5 рыбная мука-5,0 соевая мука 10,0 дрожжи кормовые -10,0, вода водопроводная до 1 л. рН - 7,3 - 7,4. В инокулятор засевают посевной материал,полученный смывом со скошенного агара рабочей партии штамма.(3) -07/Б. Штамм депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов по 0253. Через 24-26 часов начинается споро - и кристаллообразование культуры, заканчивающееся к 44-48 часам роста. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной используют также среду 7 А. Культивирование заканчивается к 24-28 часам роста после полного заспоровывания культуры. Концентрирование полученной культуральной жидкости проводят сепарированием или центрифугированием. Концентрат со стабилизатором, высушивают на распылительной сушилке. Затем проводят стандартизацию препарата наполнителем - каолином и получают сухой порошок. Состав сухого порошка- концентрат спорокристаллического комплекса с остатками питательной среды - 60-70 ,3 натрия хлорид или сульфат аммония - 1- каолин до 100 . Существенным отличительным признаком предлагаемого способа от прототипа является использование соевой и рыбной муки в приготовление питательной среды, что позволило сбалансировать состав среды и использование нового штамма.(3) -07/Б. Это позволило сократить время культивирования до 24-28 часов и увеличить титр спор в 5-10 раз. Пример 1. Стерильную среду МПА с дрожжевым автолизатом разливают в стерильные пробирки,диаметром 16 мм, по 7-8 мл и скашивают. Производят засев суспензией, полученной в результате смыва культуры с косяка высокопродуктивного варианта стерильным физраствором или стерильной дистиллированной водой. Инкубируют в термостате при температуре(301 С) в течение 3-5 суток. Для посева в инокулятор фирмыобъемом 7 л с рабочим объемом 4 л используют суспензию,полученную путем смыва культуры с косяка рабочей партии в соотношении не менее 1 млн. спор на мл. В подготовленный стерильный инокулятор,соблюдая правила асептики, закачивают при помощи сжатого воздуха стерильную среду 7 А в объеме 3,8 л и проводят засев аппарата материалом. Устанавливают следующий режим культивирования Температура-500 оборотов в минуту мешалки расход воздуха-0,5 л/ минуту на 1 л среды с 44 часов роста К 44-48 часам роста заканчивается спорообразование. Титр жизнеспособных клеток определяют методом Пастера - Коха - 12,3 миллиарда спор/мл, концентрация белка токсина 3,0 мг/мл. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной среды применяют среду следующего состава, г/л кукурузная мука- 15,0 хлорида кальция - 1,5 рыбная мука - 5,0 соевая мука- 10,0 дрожжи кормовые -10,0 вода водопроводная до 1 лсреды - 7,3 - 7,4. Биосинтез инсектицидного штамма в ферментере проходит 26 часов при том же режиме культивирования до полного заспоровывания культуры. Титр жизнеспособных клеток - 29 миллиардов спор/мл, концентрация белка токсина 3,0 мг/мл. Культуральную жидкость передают на стадию концентрирования. Концентрирование проводят на центрифуге. Пасту после центрифугирования передают на распылительную сушку. Перед сушкой в пасту добавляют 1 натрия хлористого. Сушат при температуре на входе в сушилку (135 - 140) С и на выходе (63-70)С. Сухой порошок стандартизируют каолином до титра жизнеспособных клеток (15 5) миллиардов спор/г. Применение препарата в лабораторно-полевых условиях показало эффективность 90-98 против гусениц чешуекрылых вредителей 3-4 возрастов американской белой бабочки, капустной белянки. Опыты по проверке биологической активности проводились в ТОО Институт защиты и карантина растений г. Алматы. Пример 2. Стерильную среду МПА с дрожжевым автолизатом разливают в стерильные пробирки,диаметром 16 мм, по 7-8 мл и скашивают. Производят засев суспензией, полученной в результате смыва культуры с косяка высокопродуктивного варианта стерильным физраствором или стерильной дистиллированной водой. Инкубируют в термостате при температуре(301 С) в течение 3-5 суток. Для посева в инокулятор фирмыобъемом 7 л с рабочим объемом 4 л используют суспензию,полученную путем смыва культуры с косяка рабочей партии в соотношении не менее 1 млн. спор на мл. В подготовленный стерильный инокулятор,соблюдая правила асептики, закачивают при помощи сжатого воздуха стерильную среду 7 А в объеме 3,8 л и проводят засев аппарата материалом. Устанавливают следующий режим культивирования температура - (29,00,5)С давление в аппарате - 0,03 МПа количество оборотов мешалки - 500 оборотов в минуту расход воздуха - 0,35 л/минуту на 1 л среды с 0 до 4 часов роста- 0,5 л/ минуту на 1 л среды с 44 часов роста. К 48 часам роста заканчивается спорообразование. Титр жизнеспособных клеток определяют методом Пастера - Коха - 48,0 миллиардов спор/мл, концентрация белка токсина 4,0 мг/мл. Эту культуральную жидкость используют в качестве посевного материала на ферментации. В качестве ферментационной среды применяют среду следующего состава, г/л кукурузная мука- 15,0 хлорида кальция - 1,5 рыбная мука - 5,0 соевая мука - 10,0 дрожжи кормовые -10,0 вода водопроводная до 1 л.среды - 7,3 - 7,4. Биосинтез инсектицидного штамма в ферментере проходил 24 часа при том же режиме культивирования до полного заспоровывания культуры. Титр жизнеспособных клеток - 40,8 миллиардов спор/мл, концентрация белка токсина 3,96 мг/мл. Культуральную жидкость передают на стадию концентрирования. Концентрирование проводят на центрифуге. Пасту после центрифугирования передают на распылительную сушку. Перед сушкой к полученной пасте добавляют 1 сульфат аммония. Сушат при температуре на входе в сушилку (135 - 140) С и на выходе (63-70)С. Сухой порошок стандартизируют каолином до титра жизнеспособных клеток (155) миллиардов спор/г. Применение препарата в лабораторно-полевых условиях показало эффективность 90-98 против гусениц чешуекрылых вредителей 3-4 возрастов яблоневой моли и боярышниковой листовертки. Опыты по проверке биологической активности проводились в ТОО Институт защиты и карантина растений г. Алматы. Использование предлагаемого способа получения позволяет по сравнению с прототипом при использовании новой среды и нового штамма.(Н 3 ас) -07/ сократить срок изготовления препарата с сохранением качества и биологической эффективности препарата. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения инсектицидного препарата против чешуекрылых насекомых, путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов видав условиях аэрации на питательной среде,концентрирование полученной культуральной жидкости центрифугированием и распылительной сушкой, отличающийся тем, что в состав питательной среды входят соевая, кукурузная,рыбная мука и кормовые дрожжи, а для синтеза активного начала используют культуру.(3) -07/ КБ