Способ оптимизации метода генотипирования M.tuberculosis на основе MIRU-VNTR анализа

(51) 61 39/04 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ туберкулезной инфекции, поиск закономерностей появления и распространения инфекции в регионе. Молекулярно-генетический метод -типирования ., будучи простым и быстрым в выполнении, представляется достаточно интересным и перспективным в молекулярной эпидемиологии. Анализ числа тандемных повторов проводили в 24, 15, 12 локусах генома, а также проведено сполиготипирование клинических штаммов т.е. дискриминирующая способность методов типирования для 4 комбинаций локусов- и сполиготипирования 87 клинических изолятов Разработан оптимальный набор локусов для генотипирования Комбинация 15 - локусов ( 04, 10,16, 26, 31, 4043, 42, 47, 52, 53,21, 11, 26), в сравнении с другими комбинациями и методом сполиготипирования,обеспечивали высокую разрешающую способность(0,81), приближающуюся к значениям разрешающей способности всей совокупности 24 локусов.(72) Кожамкулов Улан Анетович Ахметова Айнур Жармухамбетовна Момыналиев Куват Темиргалиевич Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОПТИМИЗАЦИИ МЕТОДА ГЕНОТИПИРОВАНИЯ . НА ОСНОВЕ - АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к области биотехнологии и медицине, а именно к молекулярной эпидемиологии и может быть использовано для решения актуальных задач современной клинической микробиологии и эпидемиологии, в частности, изучение вспышек 25247 Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к молекулярной эпидемиологии и может быть использовано для решения актуальных задач современной клинической микробиологии и эпидемиологии, в частности, для изучения вспышек туберкулезной инфекции, поиска закономерностей появления и распространения инфекции в регионе и т.д. На сегодняшний день для молекулярногенетического типирования микобактерий туберкулеза разработано около десятка различных технологий, однако наибольшее распространение получили следующие анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов 6110 (от англ.6110,6110 ), сполиготипированиеи анализ числа тандемных повторов в различных локусах генома (от англ., ). При помощи этих методов успешно решаются разнообразные прикладные задачи молекулярной эпидемиологии (установление путей передачи, выявление возможных случаев кроссконтаминации при лабораторных исследованиях,суперинфекции или реактивации очагов при возобновлении туберкулезного процесса), а так же изучаются фундаментальные вопросы происхождения и эволюции микобактерий. Однако метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 6110 обладает рядом серьезных недостатков, затрудняющих его широкое применение в лабораторной практике. Ряд проблем связан со сложностью самой методики,необходимостью использовать большое количество бактериальной массы, длительностью процедуры анализа (до 40 дней). Как и многие другие гельэлектрофоретические методики анализа, 6110-типирование характеризуется сложностью обработки результатов. Кроме того, разрешающая способность метода недостаточна для типирования штаммов с числом 6110- фрагментов в геноме менее шести, хотя в целом такие штаммы встречаются очень редко. К основным недостаткам метода сполиготипирования можно отнести низкую,по сравнению с другими методами,дискриминирующую способность, и, следовательно,низкую информативность типирования, особенно в регионах, где преобладают эндемичные штаммы М. (например, штаммы генотипа в России и Китае). Метод амплификации варьирующих по числу тандемных повторовявляется быстрым методом типирования микобактерий. Важной особенностьюлокусов является их наследование. У микроорганизмов каждая хромосома представлена в единственном экземпляре, поэтому при размножении каждый дочерний микроорганизм будет иметь ту же кратностьлокусов, что и родительский микроб (будут иметь одинаковый генотип). Метод может быть легко воспроизведен в клинической лаборатории и пригоден для дальнейшего установления связей генетических маркеров с патогенностью и вирулентностью М., а 2 также для широкомасштабных эпидемиологических исследований. Всего в геноме М.на сегодняшний день идентифицировано несколько десятков локусов, состоящих из различного числа тандемных повторов-локусов) структур,представляющих собой гомологичные последовательности ДНК, длинной от 40 до 100 пар на оснований, лежащих в межгенных регионах генома М. . Комбинация из пяти локусов-, В, С,и , первоначально предложенных для -типирования, имела малую, по сравнению с 6110 -типированием и сполиготипированием,дискриминирующую способность. Позднее для анализа была предложена комбинация из 12 локусов (включая ранее использованные локусы - и ) - т.н. микобактериальных рассеянных повторяющихся единиц (от англ., ). При анализе глобальной коллекции штаммов типирование по разрешающей способности превосходило сполиготипирование и лишь незначительно уступало по этому параметру методу анализа 6110. На сегодняшний день известен аналог из комбинации 12-локусов, обозначаемых как 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39 и 40,получивший для, 2000, 36(3), Р.762-771). Большая вариабельность значений полиморфизма того или иного -локуса позволила предпринять попытку оптимизации схемы -типирования. за счет значительного уменьшения числа анализируемых локусов, путем исключения локусов,характеризующихся низким полиморфизмом. Подобный подход,направленный на оптимизацию протокола - анализа за счет формирования альтернативной комбинации локусов, с учетом молекулярно-генетических особенностей региональной микробной популяции,представляется весьма интересным и перспективным для использования в системах национального мониторинга туберкулезной инфекции. Молекулярно-генетический метод -типирования, будучи простым и быстрым в выполнении,представляется достаточно интересным и перспективным в молекулярной эпидемиологии. Цифровой формат данных(количество тандемных повторов в исследуемых локусах) позволяет легко сравнивать генотипические данные, полученные в разных лабораториях, а так же осуществлять их кластерный анализ. Однако при выборе дополнительных локусов и составлении различных комбинаций с целью увеличения разрешающей способности необходимо обязательно учитывать тот факт, что полиморфизм тех или иных локусов значительно 25247 отличается в разных выборках и зависит от многих факторов, таких как принцип формирования коллекции штаммов,их географическое происхождение и др. Данный метод требует дальнейшей разработки и совершенствования для определения оптимального минимального набора локусов, обеспечивающих максимальную разрешающую способность, в том числе и на территориях с высокой частотой встречаемости эндемичных штаммов. Задачей изобретения является оптимизация метода генотипирования . на основе анализа числа тандемных повторов в различных локусах генома (-). Технический результат предложена оптимальная схема метода генотипирования. на основе анализа числа тандемных повторов в 15 различных локусах генома . Данная схема позволит проводить генотипирование по 15 оптимальным и наиболее информативным локусам генома ., не применяя для анализа распространенные 24 локуса. Сущность изобретения заключается в разработке оптимального набора - локусов для генотипирования Комбинация 15- локусов ( 04, 10, 16, 26, 31, 4043, 42, 47, 52, 53, 21, 11,26), в сравнении с другими комбинациями и методом сполиготипирования,обеспечивает высокую разрешающую способность (0,81),приближающуюся к значениям разрешающей способности всей совокупности 24 локусов. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами Пример 1 Анализ числа тандемных повторов проводили в 24, 15, 12 локусах генома клинических штаммов М В работе были использованы известные последовательности праймеров 24- локусов из базы данных//.-.//. Продукты амплификации анализировались методом электрофореза в 2 агарозном геле в 1 ТАЕбуфере, с последующей окраской бромистым этидием. Число тандемных повторов в соответствующем локусе вычислялось исходя из размера ПЦР-продукта, определяемого путем сравнения размера полученного фрагмента с 100 п.о. маркером молекулярного веса ДНК -100, с использованием программного пакета.4.4.0 . Таким образом, для каждого штамма был получен 24, 15, 12-символьный цифровой паттерн, в котором каждая цифра соответствовала числу тандемных повторов в том или ином локусе. Для численной оценки дискриминирующей способности методов типирования использовали индекс Хантера-Гастона,который вычисляется по следующей формуле где- число групп, на которое данный метод разделяет всю выборку штаммов,- число штаммов в -й группе и- общее число штаммов в исследованной выборке. Это означает определение вероятности того, что два разных штамма из тестируемой выборки, будут отнесены с использованием данной методики к разным типам. Был определен индекс Хантера-Гастонат.е. дискриминирующая способность методов типирования для 4 комбинаций локусов 87 клинических изолятов М. Таблица 1 Дискриминирующая способность методов типирования для 4 комбинаций локусов Комбинация - локусов Значение индекса ХантераГастонат.е. дискриминирующая способность метода Большая вариабельность значений полиморфизма того или иноголокуса позволила оптимизировать схемутипирования М. за счет значительного уменьшения числа анализируемых локусов, путем исключения локусов, характеризующихся низким полиморфизмом. При этом комбинация 15 локусов ( 04, 10, 16, 26, 31, 40 43, 42, 47, 52, 53, 21, , 26), в сравнении с другими комбинациями, обеспечивали высокую разрешающую способность (0,81),приближающуюся к значениям разрешающей способности всей совокупности 24 локусов. Пример 2 Был определен индекс ХантераГастона т.е. дискриминирующая способность двух методов типирования 3 Таблица 2 Дискриминирующая способность двух методов типирования(комбинации локусов - сполиготипирования) Методы генотипирования Значение индекса Хантера-Гастонат.е. дискриминирующая способность метода Значение дискриминирующего индекса ХантераГастонасоставило 0,81, что демонстрирует достаточно высокую разрешающую способность метода -анализа по 15 локусам в сравнении со сполиготипированием (0,27). В процессе сравнения разрешающей способности двух методов генотипирования, использованных в нашей работе (таблица 2), было обнаружено, что наилучшие результаты достигаются при генотипировании по 15 - локусов ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ оптимизации метода генотипирования.,включающий анализ числа тандемных повторов в различных локусах генома. (-), отличающийся тем,что комбинация 15 - локусов ( 04,10, 16, 26, 31, 4043, 42, 47, 52, 53,21, 11, 26) обеспечивает высокую разрешающую способность (0,81) метода генотипирования