Способ генотипирования бруцелл до видов

(51) 12 15/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ В настоящее время известно, что участок гена 2 имеется у всех видов бруцелл. Кроме того,установлено, что генетические вариации на вышеуказанном участке коррелируют с установленными обозначениями вида, и что это генетическое изменение можно использовать в качестве стабильного диагностического маркера для определения видов бруцелл. Таким образом,дифференциация между видами основана на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов на участке гена 2 бруцелл. Метод настоящего изобретения включает в себя выделение ДНК бактерий,амплификацию специально подобранными праймерами к участку гена 2 бруцелл, который состоит из вариабельных 2 а и 2 генов с последующим расщеплением данного участка эндонуклеазой рестрикциии разделение полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле.(56) Альтон Д.Ж., Джон Л.М. Методы лабораторных исследований по бруцеллезу.-Женева,1968.-с. 84(54) СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БРУЦЕЛЛ ДО ВИДОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано для определения типовой принадлежности возбудителя бруцеллеза,паспортизации вирулентных и вакцинных штаммов бруцелл методом рестрикционного анализа, для последующей разработки вакцин и других диагностикумов. Характеристика бруцелл до видов и биоваров является эпизоотологическими данными,необходимыми для определения источника заражения. 23496 Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано для определения типовой принадлежности возбудителя бруцеллеза,паспортизации полевых и вакцинных штаммов бруцелл методом рестрикционного анализа, для последующей разработки вакцин и других диагностикумов. Характеристика бруцелл до видов является эпизоотологическими данными,необходимыми для определения источника заражения. В настоящее время единственный метод,использующийся в лабораторной практике, для дифференциальной диагностики до видов бруцелл является традиционный бактериологический метод(Альтон Д.Ж., Джон Л.М. Методы лабораторных исследований по бруцеллезу.- Женева, 1968.- с. 84). Однако данный метод не лишен существенных недостатков (недостаточная чувствительность и производительность трудности, связанные с контаминацией материала посторонней микрофлорой требует больших материальных затрат трудоемок в постановке и длителен в проведение анализа (до 1 месяца. Эффективность бактериологического метода также зависит от качества питательных сред. Данный метод не пригоден для проведения массовых прижизненных исследований, с целью выявления источника возбудителя инфекции. Новые возможности в лабораторной диагностике бруцеллезной инфекции связаны с методами молекулярной биологии. Однако, выпускаемые на сегодняшний день коммерческие тест-системы для ПЦР анализа способны лишь определить род. Идентификация видов бруцелл, используя ДНК исследования, невозможна из-за высокой степени ДНК гомологии между видами (примерно 94). В настоящее время известно, что участок гена 2 имеется у всех видов бруцелл. Кроме того,установлено, что генетические вариации на вышеуказанном участке коррелируют с установленными обозначениями вида, и что это генетическое изменение можно использовать в качестве стабильного диагностического маркера для определения видов бруцелл. Таким образом,дифференциация между видами основана на анализе длин рестрикционных фрагментов на участке гена 2 бруцелл. Метод настоящего изобретения включает в себя выделение ДНК бактерий,амплификацию специально подобранными праймерами к участку гена 2 бруцелл, который состоит из вариабельных 2 а и 2 генов с последующим расщеплением данного участка эндонуклеазой рестрикциии разделение полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Перечень фигур, чертежей и иных материалов. Фиг. 1. Приводится список олигонуклеотидов для настоящего изобретения. Фиг. 2. Электрофорез в агарозном геле,окрашенный бромистым этидием, показывает 2 наличие амплифицированного и переваренногорестрикцией участков генов 2 а и 2 . Штаммы . , . , . , .были получены из Национальной коллекции микрорганизмов ГУ НЦМР. Идентификация штаммов была подтверждена стандартным анализом биоваров (Альтон, 1988). Работа проводилась с инактивироваными изолятами штаммовкультивированными на селективном агаре. Первоначально инактивирование изолятов штаммовпроводили согласно протокола 5,4-.-0000-300-002.00-Т-193. Из инактивированных изолятов проводили выделение ДНК миниколонками, с применением набора, для выделения ДНК фирмы , США, согласно, 2006 г. Амплификация участка гена 2 ДНК. Стандартную амплификационную реакцию проводили в окончательном объеме 100 мкл,содержащего 200 мкМ каждого нуклеотида ( , ), 2.5 единицыполимеразы,приблизительно 0.1 ДНК, 1 мкл каждого олигонуклеотидного праймера и реакционного буфера. Олигонуклеотиды 32 и 33 использовались для амплификации 2 гена бруцеллы (фиг. 1). Для амплификации 2 гена использовали праймеры 34 и 35 (фиг. 1). ПЦР проводили на амплификаторе фирмыпри следующих температурных и временных параметрах денатурация цепей ДНК 94 С, 30 сек гибридизация праймеров (отжиг) - 6265 С, 30 сек удлинение или полимеризация цепей ДНК с помощью термостабильного фермента ДНКполимеразы - 72 С, 3 мин количество циклов 30. Продукты амплификации гидролизировали в 0,5 мл буферарестрикции при 65 С, 10 минут. Для визуализации амплификонов ПЦР продукта разделяли посредством электрофореза в агарозном геле с окраской этидием бромистым. Для учета результатов использовали 1-2 агарозный гель, приготовленный в рабочем буфере для электрофореза. На парафильмовой пленке смешивали 9 мкл амплифицированного продукта с 1 мкл красителя(бромфенолзаолин цеонол),предварительно разведенного ТЕ буфером, в соотношении 13. Закапывали в лунки полученную смесь, не забывая в каждую дорожку закапывать маркер молекулярных масс, который также предварительно разводили в соотношении 110 ТЕ буфером. Электрофорез,после заполнения лунок окрашенными продуктами амплификации,проводили при напряжении 120 Вольт в течение 40 мин (из расчета 8 вольт/см длины геля). Результаты электрофореза учитывали,просматривая гель под трансиллюминатором. Основываясь нарестрикции, виды могут быть разделены, как показано на фиг. 2. 1 - .. 2 - . . 3 - . . 4 -. . Технологическая и экономическая эффективность предложенного способа дифференциации бруцелл до видов достигается за 23496 счет сокращения сроков типирования возбудителя и снижения при этом материальных затрат. Это значительно сокращает продолжительность постановки диагноза, установления источника заноса инфекции и проведения эффективных противоэпизоотических мероприятий. Кроме того,предлагаемый способ контроля генома производственных вакцинных штаммов является более технологичным, экономичным и может быть использован при промышленном производстве. Способ генотипирования бруцелл до видов,включающий выделение ДНК бактерий, ее амплификацию,расщепление продуктов амплификации эндонуклеазой рестрикции и разделение полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что амплификацию проводят специально подобранными праймерами к участку гена 2 бруцелл,состоящего из вариабельных 2 а и 2 генов и расщепляют данный участок эндонуклеазой рестрикции. Фиг. 1- Список олигонуклеотидов для настоящего изобретения Фиг. 2 Результаты ПЦР на бруцеллез