Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L используемый для получения моноклональных антител к вирусу болезни Ауески

(51) 12 7/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ(57) Изобретение относится к биотехнологии и использовано в ветеринарии для диагностики домашнего скота, свиней и диагностики пушных зверей, а также в вирусологии для индикации возбудителя болезни. Штамм гибридных культивируемых клеток получают путем слияния иммунных лимфоцитов мыши линии / с клетками миеломной линии 63-8-653 и используют как продуцент моноклональных антител к вирусу болезни Ауески.(72) Асауова Женисгул Сеиткалиевна Куйбагаров Марат Амангельдыевич Абдрахманов Сарсенбай Кадырович Акибеков Оркен Султанхамитович Сураншиев Жанболат Амреевич Боровиков Сергей Николаевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет имени Сакена Сейфуллина(56) Середа С.В., Новиков Б.В., Власов А.Н. Тезисы-докладов//Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологическая конференция. Покров. -2001 23497 Изобретение относится к биотехнологии и используется в ветеринарии для диагностики домашнего скота, свиней, а также пушных зверей,применяется в вирусологии для индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды. Вирус можно обнаружить в верхних дыхательных путях, лгких, головном мозге,селезнке, печени, почках, коже, лимфатических узлах. Из организма выделяется носовым истечениям, слюной, мочой. Способы, основанные на обнаружении данных факторов, имеют ограниченное применение и пригодны лишь для выявления больных индивидуумов. В постановке диагноза на вирус болезни Ауески решающее значение имеет выделение и идентификация возбудителя болезни. Классические способы, используемые в диагностике вируса болезни Ауески микроскопия мазка,вирусологический анализ, биопроба, реакция преципитации, реакция диффузной преципитаций,иммуноферментный анализ, метод флюросценций антител (с замороженными срезами головного мозга) характеризуются трудоемкостью,длительностью анализов, низкой чувствительностью и специфичностью. Известно,что моноклональные антитела обладают высокой специфичностью и активностью. Это связано с тем, что гибридомная техника позволяет получать гомогенные препараты иммуноглобулинов,специфически взаимодействующие только с определенной антигенной детерминантой патогенного агента. Это говорит о том, что МКА можно использовать при разработке высокочувствительных тест-систем, с применением способов иммуноферментного анализа(ИФА). Известны гибридные культивируемые клетки,продуцирующие МКА к вирусу болезни Ауески. Получена панель из 32 гибридом, большинство из которых продуцировали высокоспецифичные антитела к вирусным антигенам в цитоплазме, 3 клона-специфичные только к антигенам в ядрах, 4 клона к антигенам в ядрах и цитоплазме. Четыре из 32 клонов реагировали с вирусом болезни Марека. С использованием МКА разработаны модифицированные реакции радиальной иммунодиффузии ферментного и микроферментного определения для выявления антител к вирусу болезни Ауески. (,- , - .//.. 1985 478-479 (анг) Н 86-6792. Корея). Известны штаммы гибридом,продуцирующие МКА к вирусу болезни Ауески,полученные от лабораторных мышей,иммунизированных антигеном РК-15. Известно о получении гибридных культивируемых клеток В 6 и 31, продуцирующих МКА к вирусу болезни Ауески, относящихся к иммуноглобулинам класса . (Середа С.В.,Новиков Б.В., А.Н. Власов. Тезисы -докладов Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и 2 микробиологическая практическая конференция, г. Покров 2001 год.). Предлагаемый штамм гибридных культивируемых клеток отличается от аналога тем,что разработан с использованием мышей линии(штамм УБ-95),являются иммуноглобулинами класса М с достаточно высокой активностью в ИФА. Это дает возможность использовать МКА для разработки экспресс способов диагностики болезни Ауески. Задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток,продуцирующих моноклональные антитела к вирусу болезни Ауески. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг антигена вируса болезни Ауески, в 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе(ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку из тех мышей,которые дают более высокие титры антител по ИФА. Лимфоциты селезенки иммунных мышей в количестве 3106 сливают с клетками миеломы 638-563 в присутствии 1 мл раствора, содержащего 45 (объем на объем) полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксид в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96 луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ИФА с использованием антигена вируса болезни Ауески к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 100 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают БА 4 Н 3-Д 2. Штамм гибридных клеток БА-4 Н 3-Д 2 депонирован и хранится в ДГП Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК,080409,Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский под регистрационным номером Д-1409/Д и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную 23497 миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия- 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 3106 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы секреция МКА достигает 40 мгк/мл в культуральной среде. Титры иммуноглобулинов в культуральной среде 132. Все указанные в данном пункте характеристики штамма клеток определяют методом ИФА. Характеристика полезного продукта. Моноклональные тела относятся к иммуноглобулинам классаподкласса . Константа связывания 2,410-5. Методы оценки специфичности МКА непрямой и сэндвич варианты ИФА. Контаминация штамма. Контаминантов в клетках, включая бактерии, вирусы, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70 С, а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 70. Штамм гибридных культивируемых клеток БА 4 Н 3-Д 2 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью по клеток в мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. При культивировании гибридомы на мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатнобуферного раствора (ФБР), рН - 7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР. Пример 2. Для проведения непрямого ИФА на 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют антиген вируса болезни Ауески и различных видов других антигенов по 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР, рН 7,2-7,4 при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР, готовят в ячейках панели двукратные разведения культуральной жидкости, начиная 12 и выше и асцитной жидкости 1100 и выше в объеме 100 мкл ЗФР-Тв. После инкубации в течение 1,5 часа при 37 С планшету отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой. Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против антигена определяют количественно по расщеплению субстрата Н 2 О 2 в присутствии хромогенаортофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Результаты опыта по определению специфичности МКА в непрямом варианте ИФА представлены в таблице 1. Таблица 1 Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридомы БА 4 Н 3-Д 2 Растворимые антигены 1 Антиген вируса болезни Ауески 2 Ринопневмания лошадей 3 Инфекционный ларинготрахеит кур 4 Классическая чума свиней 5 Птичий грипп 6 Бруцелла абортус Обратные величины титров моноклональных антител в культуральной в асцитной жидкости жидкости 1100 РО РО РО РО РО 112800 РО РО РО РО РО 3 23497 ПримечаниеРОреакция отрицательная. Как видно из таблицы 1, моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы БА 4 Н 3-Д 2, активно взаимодействуют с антигенам вируса болезни Ауески. Пример 3. Определение константы связывания моноклональных антител. Для установления константы связывания иммунологические планшеты в 3 рядах лунок сенсибилизировались антигеном в оптимальной концентрации и в 3 рядах ниже оптимальной. Затем на них раститровывали очищенные сульфатом аммония моноклональные антитела, начиная с 10 мкг/мл. после проявления реакции по полученным данным строили графики и определяли концентрацию антител, связывающих 50 антигена. Подставляем эти данные в формулу Ксв- 2 , гдеконцентрация иммуноглобулинов в нг/мл связывающих 50 антигена, иммобилизированного в концентрации 5 мкг/мл, 1 концентрация иммуноглобулинов в нг/мл,связывающих 50 антигена,иммобилизированного в концентрации 10 мкг/мл. При определении константы связывания моноклональных антител использовали непрямой вариант иммуноферментного анализа. Концентрация моноклональных антител,связывающих 50 антигена различна. Так,например, концентрация моноклональных антител к дерматомицету, связывающих 50 антигена составляет 600 и 300 нг. При этом линия 1 является кривой реакции моноклональных антител с оптимальной концентрацией антигена, а линия 2 кривой реакции моноклональных антител с концентрацией антигена ниже оптимальной. Одним из важных свойств моноклональных антител является аффинность, которая характеризует уровень сродства антитела к испытуемому антигену,т.е. степень совпадения (комплементарности) конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты. Аффинность может быть количественно изменена с помощью определения константы связывания. Показатель константы связывания моноклональных антител составил 2,41015 М, что свидетельствует о высокой степени совпадения конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты. Пример 4. На 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют МКА из асцитной жидкости (20 мкг/мл) в 100 мкл бикарбонатного буфера (рН 9,6) при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают по три раза ЗФР-Тв и ЗФР, вносят в ячейки антиген вируса Ауески шт. УБ-95 в концентрации 10 мкг/мл при 37 С. Панель отмывают описанным способом, готовят в ячейках двукратные разведения позитивной сыворотки свиней. В качестве отрицательного контроля использовали негативную сыворотку этого же вида животного. После выдерживания панели при 37 С в течение 1,5 ч повторяют процедуру отмывки и в ячейки вносят свиньи антитела против,меченный пероксидазой. Концентрацию связывающих антител определяют по примеру 2. Результаты исследований приведены в табл. 2. Таблица 2 Специфичность связывания моноклональных антител штамма БА 4 Н 3-Д 2 с антигенами вируса болезни Ауески шт. УБ-95 в сэндвич ИФА Антиген Показатели экстинкции вируса болезни Ауески в зависимости от степени разведения 1100 1200 1400 1800 11600 13200 шт. УБ-95 1598 1,425 1,166 1,138 0,876 0,855 Примечание Показатель экстинкции негативной (отрицательной) сыворотки был равен 0,101. Данные таблицы 2 свидетельствуют о высокой степени аффинности МКА штамма гибридомы БА 4 Н 3-Д 2 к эпитопу антигена вируса болезни Ауески шт. УБ-95. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования МКА штамма гибридомы БА 4 Н 3-Д 2 в качестве реагентов при разработке способов диагностики болезни Ауески. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных. БА 4 Н 3-Д 2-продуцент моноклональных антител к вирусу болезни Ауески. депонированный в Коллекции микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности НЦБ РК МОН РК,под регистрационным номером Д-14-09/Д,используемый при разработке методов диагностики болезней животных и индикации возбудителя болезни.