Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антител к вирусу классической чумы свиней

(51) 12 7/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. - ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке диагностических тестов для обнаружения вируса КЧС, а также для дифференциации вируса КЧС от других видов вирусов животных. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего МКА к антигену вируса КЧС с молекулярной массой 33 кДа.(72) Есенеева Салтанат Советовна Куйбагаров Марат Амангельдыевич Абдрахманов Сарсенбай Кадырович Булашев Айтбай Кабыкешович(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Ильясова Г.Х., Юсупов Р.Х., Барсоков Л.И.,Матвеева Л.И. Использование моноклональных антител для диагностики классической чумы свиней. Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Тезисы докладов Всероссийской научнопрактической конференции. Владимир, 1995. с.41 22918 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке диагностических тестов для обнаружения вируса классической чумы свиней, а также для дифференциации вируса классической чумы свиней от других видов вирусов. В настоящее время для диагностики вирусов классической чумы свиней используются серологические реакции,такие как метод иммунофлуоресценции, реакция нейтрализации,которые казались многообещающими, но не отвечают двум главным критериям для лабораторных методов - быстроте и стоимости. Кроме того, для дифференциации антител к вирусу классической чумы свиней (ВКЧС) и вируса диареи крупного рогатого скота (ВДКРС) имеют место трудности в интерпретации результатов реакции при использовании разных штаммов вирусов. (Куринов В.В., Вишняков И.Ф., Лыска В.М. Лабораторная диагностика классической чумы свиней-критическая оценка методов) Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии г. Покров стр. 30.) Способы диагностики вирусных болезней свиней, основанные на иммуноферментном анализе(ИФА), имеют большую перспективу в части внедрения в практику. Однако, недостатком иммуноферментных способов диагностики является использование в них поликлональных антител, что снижает их специфичность, чувствительность и является главным препятствием при внедрении в диагностическую практику. Поэтому ИФА как диагностический тест будет иметь ценность лишь в том случае, когда в нем будут использованы в качестве основного реагента моноклональные антитела(МКА),позволяющие качественно повысить специфичность анализа,характеризующиеся постоянными свойствами, т.е. имеющие моноклональное происхождение и доступные в неограниченном количестве. В настоящее время моноклональные антитела к пестивирусам широко используются для рутинной дифференциации изолятов ВКЧС и ВДКРС с использованием конкурентных методов ИФА. Сравнительный анализ 47 изолятов пестивирусов,проведенный с помощью 50 видов МАТ,полученных в различных лабораториях, четко показал, что МАТ с высокой эффективностью дифференцируют антигенные варианты вирусов. Было обнаружено множество различии среди штаммов, имеющих одно и тоже внимание, но полученных из различных лабораторий и прошедших различное число пассажей. (И.Ф. Вишняков, Л.Я. Цыбанова Новые методы диагностики классической чумы свиней/Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии,ВНИИВВиМ, г. Покров, 1994 г., с.69-71). Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту прототипом является штамм гибридных культивируемых клеток МКА к вирусу классической чумы свиней. (См. Г.Х. Ильясова, Р.Х. Юсупов, Л.И. Барсоков, Л.И. Матвеева. Использование моноклональных антител для диагностики классической чумы 2 свиней./Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Тезисы докладов Всероссийской научнопрактической конференции, г. Владимир 1995,с. 41). Предлагаемый штамм гибридных культивируемых клеток отличается от прототипа тем, что получен в результате гибридизации иммунных спеленоцитов линейной мыши с клетками миеломы 63-8-563 (1106) с помощью 45 полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000,тогда как при создании аналога использовалась миеломная линия 2/0 и полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1500. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела к вирусу классической чумы свиней (КЧС). Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг очищенного антигена вируса классической чумы свиней в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг этого же антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Клетки селезенки (В-лимфоциты) иммунных мышей в количестве 1107 гибридизируют с клетками миеломы 63-8-563(1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ИФА с использованием очищенного антигена вируса КЧС к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на среде с ГАТ и затем постепенно переводят на среду,содержащую гипоксантин-тимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток,продуцирующих МКА к антигенам вируса КЧС,дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. Продуктивный клон гибридомы, обозначенный как ЗЕ 9-КТ депонирован в Коллекции микроорганизмов ДТП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности НЦБ РК КН МОН Республики Казахстан (080409, 22918 Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский) под регистрационным номером М-1109/Д и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки адаптированы к росту в среде -1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ -глютамина- 3,375 г/л 2 меркаптоэтанола - 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2 х 106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы, концентрация МКА составляет 0,035-0,040 мг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ИФА-132, в асцитной жидкости 1128000. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса , подкласса 1. Способы оценки специфичности МКА ИФА. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 6-8 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5 х 106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при - 70 С на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы ЗЕ 9-КТ используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см 3 по 5 х 103 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии /, которым предварительно инъецировали пристан(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Специфичность определяют в ИФА с использованием антигенов различных видов вирусов животных. Для проведения ИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют очищенные антигены в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР,рН 7,2-7,4. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости (КЖ) или асцитной жидкости (АЖ) начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата(антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 2 М раствора 2 О 4. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темно 3 22918 коричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице 1. Как видно из приведенных в таблице 1 результатов, полученные моноклональные антитела активно взаимодействуют с очищенным антигеном вируса КЧС, слабо реагируют с антигеном вируса диареи КРС и не реагируют с другими видами вирусов. Таблица 1 Изучение специфичности и активности МКА штамма гибридомы ЗЕ 9-КТ в непрямом варианте ИФА Титры МКА Культуральная Асцитная жидкость жидкость Растворимые антигены флавиавирусов Вирус КЧС, шт. КС (очищенный препарат вируса) 132 112800 Вирус диареи КРС шт. Орегон 12 1100 Вирус болезни Ауески шт. УБ-95 РО РО Вирус гриппа птиц 11 РО РО Вирус лейкоза КРС РО РО Примечание - РО - реакция отрицательная. Таким образом,результаты опыта свидетельствуют о специфичности МКА гибридомы 3 Е 9-КТ к антигенам вируса КЧС, что позволяет получать на их основе эффективные диагностические препараты для индикации и дифференциации вируса КЧС. Пример 2. Постановка иммуноблотинга предусматривала следующие этапы 1) проведение электрофореза 2) перенос электрофореаграммы на нитроцеллюлозную мембрану 3) иммунохимическое проявление нитроцеллюлозной реплики. Электрофоретический перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли с помощью прибора для иммуноблотинга ((Англия) по Н.. Для иммунохимического проявления специфических антигенов нитроцеллюлозную мембрану сначала инкубировали в 1 растворе БСА в течение ночи при 4 С. Затем отмывали по три раза ЗФР и ЗФР-Тв и выдерживали 1,5 ч при 37 С в растворе моноклональных антител из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1100 в ЗФР-Тв. После чего носитель вновь отмывали и инкубировали в рабочем разведении антивидовых антител,меченых пероксидазой хрена (1 ч при 37 С). Повторяли процедуру отмывки и проявляли реакцию. Раствор субстрата готовили непосредственно перед использованием следующим образом 0,01 г 4-хлор-нафтола (, США),растворяли в 2 мл метанола, смешивали с 18 мл ЗФР(рН 7,2-7,4) и добавляли 0,01 мл 3- перекиси водорода. Результаты иммуноблотинга показали, что моноклональные антитела реагировали с белками вируса КЧС молекулярной массой 33 кДа (фиг.1). По результатам А.Д. Середа, Л.Г. Фугина и др. ВНИИВВиМ, в лизатах клеток РК-15, зараженных вирусом КЧС, шт. ЛК-ВНИИВВиМ, Полтава,определены полипептиды с молекулярными массами 25,31,33,55 и 83 кДа. Таким образом, моноклональные антитела получены к антигенам вируса классической чумы свиней, молекулярная масса которого соответствует белкам вируса. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных. 3 Е 9-КТ, депонированный в Коллекции микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности НЦБ РК МОН РК,под регистрационным номером М-11-09/Д,используемый для получения моноклональных антител к вирусу классической чумы свиней.