Способ получения типоспецифических диагностических антитоксических сывороток Clostridium perfringens типов А, B, C, D и Clostridium oedematiens

(51) 61 39/08 (2011.01) 61 10/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ способа получения высокоспецифичных типоспецифических диагностических антитоксических сывороток для определения токсиновтипов А, В, С,и. Способ получения типоспецифических диагностических антитоксических сыворотоктипов А, В, С,ивключающий иммунизацию животныхдоноров антигеном, получение от них крови и отделение сыворотки, предварительно проводят шестикратную иммунизацию овец путем подкожного введения им концентрированных анатоксинов, каждого типа отдельно, с интервалом 5 дней в увеличивающихся дозах от 1,0 см 3 до 32,0 см 3, затем на 8 день после последней иммунизации у животных берут кровь в количестве 14 см 3 на килограмм живого веса продуцента, отделяют сыворотку и получают целевой продукт, с активностью в 1 см 3 тип А 5 АЕ альфа антитоксина,типов В, С 10 АЕ бета-антитоксина,тип 20 АЕ эпсилон-антитоксина и 10 АЕ.(72) Горелов Юрий Михайлович Сущих Владислава Юрьевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Инструкция по изготовлению и контролю антитоксических сывороток . р типов А, В, С,диагностических М. ВГНКИ, 1998.-26 с(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИПОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ АНТИТОКСИЧЕСКИХ СЫВОРОТОКТИПОВ А, , ,И(57) Изобретение относится к области биотехнология, а именно к способу получения диагностических препаратов, и может быть использовано в производстве типоспецифических диагностических антитоксических сывороток ктипов А, В, С,и 25248 Изобретение относится к области биотехнология,а именно к способу получения диагностических препаратов, и может быть использовано в производстве типоспецифических диагностических антитоксических сывороток ктипов А, В, С,и. Известен способ получения типоспецифических диагностических антитоксических сыворотоктипов А, В, С,включающий иммунизацию животных-доноров антигеном,получение от них крови и отделение сыворотки(Инструкция по изготовлению и контролю антитоксических сывороток С 1.типов А,В, С,диагностических М. ВГНКИ, 1998.-26 с.). Недостатком данных антитоксических сывороток является то, что они не имеют в своем составе диагностической сыворотки к,необходимой для высокой специфичности диагностических исследований. Задачей изобретения является разработка способа получения типоспецифических диагностических антитоксических сывороток для определения токсиновтипов А, В, С,ипри установлении диагноза у животных на анаэробные заболевания. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается изыскании оптимального способа получения высокоспецифичных типоспецифических диагностических антитоксических сывороток для определения токсиновтипов А, В, С,и. Способ получения типоспецифических диагностических антитоксических сывороток для определения токсиновтипов А, В, С,ивключающий иммунизацию животных-доноров антигеном,получение от них крови и отделение сыворотки,предварительно проводят шестикратную иммунизацию овец путем подкожного введения им концентрированных анатоксинов, каждого типа отдельно, с интервалом 5 дней в увеличивающихся дозах от 1,0 см 3 до 32,0 см 3, затем на 8 день после последней иммунизации у животных берут кровь в количестве 14 см 3 на килограмм живого веса продуцента, отделяют сыворотку и получают целевой продукт, с активностью в 1 см 3 тип А 5 АЕ альфа антитоксина,типов В, С 10 АЕ бета-антитоксина,тип 20 АЕ эпсилон-антитоксина и 10 АЕ. В способе используется штаммы бактерийтип А 28 В-0041,тип В В-0042,тип С 219 В-0044,тип 213 В-0043 и 34 В-0132, депонированнные в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт. Идентификацию штаммов культурипроводят по морфологическим, культуральным и физиолого 2 биохимическим свойствам согласно определителю 3,,/, 2009. -,. - 1074-1086 . Штаммы характеризуются следующими признаками. Штамм бактерийтип А 28 В-0041. Морфологические свойства. Штаммтип А 28 представляет собой изолированные грамотрицательные палочки с обрубленными концами длиной 4-8 мКм, шириной 1,0-1,5 мКм, не подвижные. Культуральные свойства. Штаммтип А растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 3738 С, с обильным газообразованием, сбраживает мальтозу, галактозу, сахарозу, глюкозу, лактозу, не разлагает салицин, разжижает желатину, образует сероводород и индол. Спорообразование. Штаммтип А образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигенатип А образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. 18-24-часовая культура штамматип А вызывает гибель белых мышей в дозе 0,4 см 3. Реактогенность. Культуратип А, введенная внутримышечно морским свинкам,в дозе 2,5 х 107 микробных тел объеме гибель животных через 12-18 часов. Иммунохимические - образует 4 линии преципитации с сывороткой противоперфрингенс типа А. Реверсабельность. Штаммтип А,по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамматип А, стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 40-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штаммтип В В-0042. Морфологические свойства. Штаммтип В представляет собой изолированные грамотрицательные палочки с обрубленными концами длиной 4-8 мКм, шириной 1,0-1,5 мКм, не подвижные. 25248 Культуральные свойства. Штаммтип В растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 3738 С, с обильным газообразованием, сбраживает мальтозу, галактозу, сахарозу, глюкозу, лактозу, не разлагает салицин, разжижает желатину, образует сероводород и индол. Спорообразование. Штаммтип В образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигенатип В образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Вирулентность. 20-24-часовая культура штамматип В вызывает гибель белых мышей в дозе 0,5 см 3. Реактогенность. Культуратип В, введенная внутримышечно морским свинкам,в дозе 2,5 х 107 микробных тел объеме гибель животных через 18-20 часов. Иммунохимические - образует 4 линии преципитации с сывороткой противоперфрингенс типа А. Реверсабельность. Штаммтип В,по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамматип В, стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штаммтип С 219 В 0044. Морфологические свойства. Штаммтип С 219 представляет собой изолированные грамотрицательные палочки с обрубленными концами длиной 4-8 мКм, шириной 1,0-1,5 мКм, не подвижные. Культуральные свойства. Штаммтип С 219 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 37-38 С, с обильным газообразованием,сбраживает мальтозу, галактозу, сахарозу, глюкозу,лактозу, не разлагает салицин, разжижает желатину,образует сероводород и индол. Спорообразование. Штаммтип С 219 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигенатип С 219 образуются специфические агглютинины в титрах 116-132. Вирулентность. 20-24-часовая культура штамматип С 219 вызывает гибель белых мышей в дозе 0,5 см 3. Реактогенность. Культуратип В, введенная внутримышечно морским свинкам,в дозе 2,5 х 107 микробных тел объеме гибель животных через 18-24 часов. Иммунохимические - образует 1 линию преципитации с сывороткой противоперфрингенс типа В. Реверсабельность. Штаммтип С 219, по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамматип С 219, стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Воспалительную реакцию на месте введения с повышением местной температуры на 0,5-1,0 С и значительным отеком, гибель животных наступает через 4-5 сутки. Штаммтип 213 В 0043. Морфологические свойства. Штаммтип 213 представляет собой изолированные грамотрицательные палочки с обрубленными концами длиной 4-8 мКм, шириной 1,0-1,5 мКм, не подвижные. Культуральные свойства. Штаммтип 213 растет на жидких питательных средах (МППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 37-38 С, с обильным газообразованием,сбраживает мальтозу, галактозу, сахарозу, глюкозу,лактозу, не разлагает салицин, разжижает желатину,образует сероводород и индол. Спорообразование. Штаммтип 213 образует большие споры продолговатой и круглой формы, расположенные центрально или субтерминально. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигенатип 213 образуются специфические агглютинины в титрах 132-164. Иммунохимические - образует 2 линии преципитации с сывороткой противоперфрингенс типа В. Вирулентность. 20-24-часовая культура штамматип 213 вызывает гибель белых мышей в дозе 0,5 см 3. Реактогенность. Культуратип 213, введенная внутримышечно морским свинкам, в дозе 2,5 х 107 микробных тел объеме гибель животных через 18-24 часов. Реверсабельность. Штаммтип 213, по основным культуральным,3 25248 морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамматип 213, стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток, на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Штамм 34 В-0132. Морфологические свойства. Штамм 34 представляет собой прямые крупные грамотрицательные палочки или короткие цепочки палочек с обрубленными и округленными концами длиной 5-10 мКм, шириной 1,0-1,5 мКм.34 подвижные палочки с перетрихальными жгутиками. Культуральные свойства. Штамм 34 растет на жидких питательных средах (ППБ, МПК, ПГКМД) при температуре 3738 С, с обильным газообразованием, сбраживает мальтозу, галактозу, глюкозу не разлагает салицин,разжижает желатину, образует сероводород и не образует индол. Спорообразование. Штамм 34 образует споры продолговатой и круглой формы, расположенные субтерминально. Иммунохимические - образует 6-7 линий преципитации с сывороткой противоэдематиенс типа А, серотип 1. Антигенные свойства. В организме животных после введения антигена 34 образуются специфические агглютинины в титрах 164. Вирулентность. 24-часовая культура штамма 34 вызывает гибель морских свинок при подкожном введении бульонной культуры 1,0 см 3 через 18-48 часов. Реверсабельность. Штамм 34,по основным культуральным,морфологическим и биологическим свойствам не отличается от эпизоотических культур. Многократные пересевы не изменяют морфологических и культуральных свойств. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма 34, стабильно сохраняются на питательной среде Китт-Тароцци в течение 30-90 суток,на среде ПГКМД до 12 месяцев. 4-5 разовые пассажи культуры на питательных средах не изменяют его свойств. Лиофильно высушенные культуры сохраняют свои исходные свойства не менее 2-х лет. Пример 1. Приготовление антигенов для иммунизации животных-продуцентов. Предварительно проверенные на чистоту типовые штаммытипов А, В, С,и индивидуально в жидкую питательную среду МППБ. Посевы ставят в термостат при температуре 37 С на 6-10 часов. Одновременно, для проверки чистоты и типичности микрофлоры, проводят посев в пробирки на МПА, МПБ, МППБ и чашки с кровяным агаром. К выросшим культурам микроорганизмов добавляют 0,6 формалина из расчета содержания в нем 40 формальдегида и выдерживают их в термостате при температуре 37-38 С 5-10 суток. Культуры 1.типапредварительно активируют путем добавления 110 стерильного раствора трипсина (0,5) или панкреатина (2,5). При изготовлении анатоксинов с целью удаления микробных клеток культуры центрифугируют в течение 30 минут при 3000 об/мин, выдерживают 1015 суток при 37-38 С. Полученные анатоксины сорбируют алюмокалиевыми квасцами в соотношении 110 и концентрируют путем декантации 50-70 надосадочной жидкости, доводят рН до 7,4 и используют для грунтиммунизации продуцентов. Хранят анатоксины в течение 18 месяцев при температуре 2 15 С. Пример 2. Иммунизация животных - продуцентов. Приготовленные концентрированные анатокси-ны(антигены)типов А, В, С,каждый тип отдельно ивводят под кожу овцам в области спины, подгрудка с соблюдением всех правил асептики. Для каждого типа анатоксина используют двух или трех продуцентов. В первый день анатоксин вводят в дозе 1 см 3, на 5 день 2 см 3, на 10 день 4 см 3, на 14 день 8 см 3, на 20 день 16 см 3, и на 25 день 32 см 3. Через 8 дней после последнего введения антигена у животных берут кровь в количестве 14 см 3, на килограмм живого веса продуцента и получают сыворотку путем отстоя. Животным после взятия крови дается отдых в течение 15 дней. Повторно антигены, каждый раздельно, вводят животным-продуцентам в тех же объемах. На 8 и 10 день после последнего введения антигена у животных вновь берут такое же количество крови и путем отстоя получают сыворотку. После 15 дневного отдыха животных снова иммунизируют два раза с интервалом 5 дней. Продуцентов,от которых получают типоспецифические сыворотки,содержат в изолированных друг от друга станках. Последующий цикл иммунизации животных можно повторять после каждых 15 дней их отдыха и таким образом эксплуатировать продуцентов в течение 3-5 лет. Пример 3. Получение типоспецифических диагностических антитоксических сывороток. От гипериммунизированных животных- доноров кровь берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в стерильные цилиндры или флаконы,стенки которых увлажнены физиологическим раствором хлорида натрия. Для лучшего отделения сыворотки, цилиндры с кровью помещают на 2 часа в теплую воду 38 С, 25248 затем делают обводку, чтобы сгусток осел на дно и переносят в холодильную камеру 2 С, через 20-24 часов делают слив сыворотки в стерильные бутыли. Через сутки можно повторить кровопускание у животных-доноров из расчета 15-16 см 3 крови на 1 кг массы животного. Полученную антитоксическую сыворотку фильтруют через асбестовые пластины Ф и СФ или фильтры Милипор или Владипор с диаметром пор 0,2 микрон. Проверенную на стерильность, безвредность,активность и специфичность антитоксическую сыворотку разливают в ампулы по 3-5 см 3,маркируют и хранят при температуре 2 8 С в темном помещении. Пример 4. Определение активности и специфичности полученных типоспецифических диагностических антитоксических сывороток. Активность сывороток определяют количеством антитоксических единиц (АЕ) в 1 см 3 сыворотки. Антитоксической единицей сыворотки называется то количество ее, которое способно нейтрализовать 100 минимальных смертельных доз токсина (ДЛМ) для белой мыши массой 16-18 г. Специфичность сыворотки определяют путем реакции нейтрализации токсиновтипов А, В, С,исоответствующим типом сыворотки. Определение АЕ в сыворотке крови. Растворяют сухой токсин в физиологическом растворе с таким расчетом, чтобы в 1 см 3,содержалось 40 ДЛМ токсина. Сыворотку крови разводят физраствором в соотношении 15, 110, 120,125, 150, 1100, 1150, 1300. Затем 1 см 3,разведенной сыворотки соединяют с 1 см 3,раствора токсина и получают 40 ДЛМ, после чего смесь токсина с сывороткой ставят на 45 минут в термостат при 37 С для нейтрализации. Затем 0,5 см 3 смеси токсина с сывороткой вводят внутривенно белой мыши массой 16-18 г. На каждое разведение сыворотки используют не менее двух белых мышей. Одновременно ставят контроль токсина. Для проверки специфичности ставят перекрестную реакцию нейтрализации. Пример 5. Контроль типоспецифических диагностических антитоксических сывороток для определения токсиновтипов А, В, С,и. Физико-химические и биологические свойства. Внешний вид, цвет. Слегка опалесцирующая коричневая жидкость с рыхлым сероватым осадком,легко разбивающимся в гомогенную взвесь. Наличие посторонних примесей. Сыворотки не должна содержать посторонних примесей, плесени,не разбивающихся конгломератов. Показатель рН (водородных ионов) от 7,0 до 7,2. Стерильность. Посевы и пересевы на бактериологические питательные среды в течение 35 суточного выдерживания при температуре от плюс 20 до плюс 37 С должны оставаться стерильными. Безвредность. Введение типоспецифических сывороток подкожно трем морским свинкам, в дозе 10 см 3, по 5,0 см 3 правой и левой стороны и трем белым мышам в дозе 0,5 см 3, не должна вызывать их гибели в течение 10 - суточного наблюдения. Активность и специфичность. Антитоксические сыворотки содержат в 1 см 3 тип А 5 АЕ альфа антитоксина,типов В, С 10 АЕ бета-антитоксина,тип 20 АЕ эпсилонантитоксина,10 АЕ. Термостабильность. При температуре от 2 до 8 С 24 месяца. Апробация типоспецифических диагностических антитоксических сывороток для определения токсиновтипов А, В, С,ив лабораторных условиях с патологическим материалом полученным из неблагополучных по анаэробным инфекциям животноводческих и овцеводческих хозяйств Алматинской области показала, что опытные сыворотки являются активными и высокоспецифичными. Использование способа получения типоспецифических диагностических антитоксических сывороток для определения токсиновтипов А, В, С,ипозволит идентифицировать культуры клостридий и значительно ускорить лабораторную диагностику при анаэробных инфекциях. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения типоспецифических диагностических антитоксических сыворотокр типов А, В, С,ио, включающий иммунизацию животныхдоноров антигеном, получение от них крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что предварительно проводят шестикратную иммунизацию овец путем подкожного введения им концентрированных анатоксинов, каждого типа отдельно, с интервалом 5 дней в увеличивающихся дозах от 1,0 см 3, затем на 8 день после последней иммунизации у животных берут кровь в количестве 14 см 3 на килограмм живого веса продуцента,отделяют сыворотку и получают целевой продукт, с активностью в 1 см 3 р тип А 5 АЕ альфа-антитоксина,р типов В, С 10 АЕ бета-антитоксина,р тип 20 АЕ эпсилон-антитоксина ио 10 АЕ.