Способ получения ротавирусного антигена для изготовления диагностических специфических сывороток

(51) 61 39/15 (2010.01) 12 7/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ исходного материала используют штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы /96/ 0041 КазНИВИ, который репродуцируется в клеточных системах почки телят, свиньи и кролика, заражение вирусом культур клеток, культивирование вируса и определение его цитопатогенного действия, сбор вируссодержащей суспензии и накопление антигена,определение биологической активности вирусного материала, очистка и концентрирование вирусной массы путем центрифугирования, высаливания и ультрацентрифугирования,при этом вируссодержащую суспензию центрифугируют при 10000 в течение 15 мин, полученный осадок с обломками дегенерированных клеток отбрасывают,надосадочную вируссодержащую суспензию концентрируют методом высаливания 20-ным содержанием сульфата аммония с последующим центрифугированием через 15-16 ч при 10000 в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в буферев объеме 110,полученную вируссодержащую суспензию концентрируют ультрацентрифугированием при 120000 в течение 30 мин в градиенте плотности сахарозы, при этом надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в питательной среде 199 в соотношении 110 при рН 7,2-7,4,определяют биологическую активность путем титрования в пробирочных культурах клеток и при титре вируса 108 ТЦД 50/см 2 используют в качестве целевого продукта.(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОТАВИРУСНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при разработке и изготовлении антигенов и специфических высокоактивных сывороток средств для диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в увеличении объема очищенного и концентрированного антигена,используемого для изготовления высокоактивных диагностических специфических сывороток. Способ получения ротавирусного антигена для изготовления диагностических специфических сывороток, включающий заражение вирусом чувствительной клеточной системы,культивирование и очистку ротавирусов, в качестве 23381 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при разработке и изготовлении антигенов и специфических высокоактивных сывороток средств для диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Известен способ получения ротавирусного антигена,включающий заражение вирусом чувствительной клеточной системы,культивирование и очистку ротавирусов Копьев В.П., Бабурина Т.М., Брылина В.Е., Пантелеев О.В. Вопросы ветеринарной биологии. 1988. с.98-99. Недостатком известного способа получения ротавирусного антигена является потеря 1/5 части накопленного вируса для изготовления диагностического набора. Задачей предлагаемого способа получения ротавирусного антигена является повышение антигенности вирусной массы путем сохранения титра вируса,пригодного для получения высокоспецифичной антисыворотки. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в увеличении объема очищенного и концентрированного антигена,используемого для изготовления высокоактивных диагностических специфических сывороток. Способ получения ротавирусного антигена для изготовления диагностических специфических сывороток, включающий заражение вирусом чувствительной клеточной системы,культивирование и очистку ротавирусов, в качестве исходного материала используют штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы /96/0041 КазНИВИ, который репродуцируется в клеточных системах почки телят, свиньи и кролика, заражение вирусом культур клеток, культивирование вируса и определение его цитопатогенного действия, сбор вируссодержащей суспензии и накопление антигена,определение биологической активности вирусного материала, очистка и концентрирование вирусной массы путем центрифугирования, высаливания и ультрацентрифугирования,при этом вируссодержащую суспензию центрифугируют при 10000 в течение 15 мин, полученный осадок с обломками дегенерированных клеток отбрасывают,надосадочную вируссодержащую суспензию концентрируют методом высаливания 20-ным содержанием сульфата аммония с последующим центрифугированием через 15-16 ч при 10000 в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в буферев объеме 110,полученную вируссодержащую суспензию концентрируют ультрацентрифугированием при 120000 в течение 30 мин в градиенте плотности сахарозы, при этом надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в питательной среде 199 в соотношении 110 при рН 7,2-7,4,определяют биологическую активность путем титрования в пробирочных культурах клеток и при титре вируса 10 ТЦД 50/см 2 используют в качестве целевого продукта. Способ осуществляется следующим образом. 2 Для получения ротавирусного антигена используют казахстанский штамм ротавируса крупного рогатого скотаАлматы/96/0041 - КазНИВИ, который хранится в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Казахского научноисследовательского ветеринарного института(КазНИВИ). Пример 1. Изготовление 1 литра ротавирусного антигена В качестве исходного вируса используют штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы /96/ 0041 - КазНИВИ, который репродуцируют в чувствительных клеточных системах из почки теленка, свиньи и кролика в высоких титрах вследствие активации культивирования вируса добавлением оттитрованного 0,25 раствора трипсина в соотношении 11 к вирусной суспензии. Зараженные культуры клеток оставляют 1,5 ч при комнатной температуре в контакте с смесью вирусной суспензией с трипсином. По истечении времени смесь вирусной суспензии с трипсином выливают и заливают зараженные культуры поддерживающей средой 199 без сыворотки крови. Ростовые среды с контрольных культур клеток сливают и оставляют их в поддерживающей среде,после чего зараженные и контрольные культуры помещают в термостат при 37 С. Затем ежедневно в течение 4-5 дней все флаконы просматривают под микроскопом (об 10 х, ок 7 х) для установления цитопатогенного действия (ЦПД) ротавируса на культуры клеток. Цитопатический эффект проявляется в течение 4-5 сут на 80, остаток монослоя стряхивают, снимают со стекла и накапливают вируссодержащий материал. Накопленный вируссодержащий материал подвергают очистке и концентрированию. Для этого вируссодержащую суспензию центрифугируют при 10000 в течение 15 мин, полученный осадок с обломками дегенерированных клеток отбрасывают,надосадочную вируссодержащую суспензию концентрируют методом высаливания 20-ным содержанием сульфата аммония с последующим центрифугированием через 15-16 ч при 10000 в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в буферев объеме 110,полученную вируссодержащую суспензию концентрируют ультрацентрифугированием при 120000 в течение 30 мин в градиенте плотности сахарозы, при этом надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в питательной среде 199 в соотношении 110 при рН 7,2-7,4,определяют биологическую активность путем титрования в пробирочных культурах и при титре вируса 108 ТЦД 50/см 2 используют в качестве антигена для изготовления диагностических специфических сывороток. Пример 2. Культивирование ротавируса на культурах клеток. Выращивание перевиваемых культур клеток производят в питательных средах 199, Игла ,Игла ВМЕ с добавлением 5 фетальной сывороткой крови. Ротавирус крупного рогатого скота штамм 23381 Алматы-/96/ выделен от больного диареей теленка 4- дневного возраста в СПК им. Д. А. Кунаева Алматинской области. Идентификацию выделенного штамма проводили в сравнении с эталонным штаммом -11 и музейным штаммом ротавируса крупного рогатого скота- ПК 007. Вирус репродуцируют на перевиваемых культурах клеток почки быка - МДБК, почки свиньи - РК-15, почки кролика-ЯК-13, почки телят - ПТ и ПТ-80. Цитопатический эффект появлялся через 48 часов после заражения в виде разрыхления монослоя клеток. Через 54-60 ч зараженные клетки монослоя округлялись, группировались, вследствие чего образовывались пустоты между клетками. На 66 -72 ч указанные пустоты окна увеличивались в размерах, становились округлой формы и появлялись серповидные клетки с растянутой цитоплазмой, отмечались загнутые места на краю монослоя. К 4-5 сут после заражения поражался 7080 пласта клеточного монослоя, при котором остаток монослоя снимают встряхиванием и вируссодержащую суспензию замораживают при 20 С. Определение биологической активности накопленной вирусной массы проводят на культуре клеток МДБК, выращенной в пробирках. На каждую серию вирусного материала берут по 12 пробирок с выросшим монослоем (3 опыта по 4 пробирки), на каждое разведение вируса по 8 пробирок (2 повтора по 4 пробирки), всего 92 пробирки опытных и 12 пробирок контрольных. Опытные пробирки с выросшим монослоем культур клеток МДБК заражают ротавирусом (штамм Алматы/96/) в соотношении 110, в контрольных пробирках ростовую среду заменяют на поддерживающую. Опытные и контрольные пробирки ставят в термостат при 37 С и ежедневно просматривают под микроскопом для установления сроков ЦПД. Культуры клеток подвергались ЦПД вируса в течение 3-5 сут, причем в пробирках, где 80 клеточного пласта ЦПД вируса за 3 сут, титр накопления ниже, чем за 5 сут. Результаты титрования вирусного материала приведены в таблице 1. Из таблицы 1 следует, что средний титр вирус(по Риду и Менчу) равняется 6,00,01 ТЦД 50/см 3 так как за биологическую активность вируса принимается наибольшее разведение вируса,вызывающее 50 цитопатический эффект. При этом в контрольных пробирках дегенеративных изменений не наблюдалось. Полученный вируссодержащий материал подвергают очистке и концентрированию как в примере 1 и получают целевой продукт очищенный и концентрированный вирусный антиген биологическая активность которого равна 8,0 ТЦД 50/см 3, пригодный для получения высокоспецифичной антисыворотки. Антиген и сыворотка составляют основу разработанного диагностикума ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Применение ротавирусного антигена позволит получить высокоактивные специфические сыворотки для диагностики ротавирусной инфекции. Таблица 1 Результаты титрования вирусного материала Наименование титруемого материала Вируссодержащий материал от 8.12. Титр Средний вируса титр вируса Примечания 1 М - среднее значение 2- стандартное отклонение ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения ротавирусного антигена для изготовления диагностических специфических сывороток, включающий заражение вирусом чувствительной клеточной системы,культивирование и очистку ротавирусов,отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы/96/ 0041-КазНИВИ, заражают вирусом культуры клеток, культивируют вирус и определяют его цитопатогенное действие,собирают вирусосодержащую суспензию и накопляют антиген, определяют биологическую активность вирусного материала, очищают и концентрируют вирусную массу путем центрифугирования,высаливают и ультрацентрифугируют, при этом вируссодержащую суспензию центрифугируют при 10000 в течение 15 мин, полученный осадок с обломками 3 23381 дегенерированных клеток обрасывают,надосадочную вируссодержащую суспензию концентрируют методом высаливания 20-ным содержанием сульфата аммония с последующим центрифугированием через 15-16 ч при 10000 в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в буферев объеме 110,полученную вирусосодержащую суспензию концентрируют ультрацентрифугированием при 120000 в течение 30 мин в градиенте плотности сахарозы, при этом надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в питательной среде 199 в соотношении 110 при рН 7,2-7,4,определяют биологическую активность путем титрования в пробирочных культурах клеток и при титре вируса 108 ТЦД 50/см 2 используют в качестве целевого продукта.