Способ идентификации фенотипически и генетически близких видов бактерий рода Lactobacillus на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена кодирующего лейцил-тРНК синтетазу (leuS)

(51) 61 35/74 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ГЕНА КОДИРУЮЩЕГО ЛЕЙЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗУ(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и касается достоверной идентификации бактерий родаметодом анализа нуклеотидной последовательности гена,кодирующего лейцил-тРНК синтетазу. Подобраны универсальные праймеры 379,1297 и условия постановки ПЦР реакции,которые позволяют амплифицировать фрагментгена, а также могут быть использованы для прямого определения его нуклеотидной последовательности. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента данного гена позволяет проводить идентификацию фенотипически и генетически близких видов бактерий рода . Дискриминационная возможность предлагаемого способа превышает ранее использованные способы,основанные на анализе нуклеотидных последовательностей 16 гена.(72) Шевцов Александр Борисович Кушугулова Алмагуль Рахимберлиевна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФЕНОТИПИЧЕСКИ И ГЕНЕТИЧЕСКИ БЛИЗКИХ ВИДОВ БАКТЕРИЙ РОДАНА ОСНОВЕ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Изобретение относится к области биотехнологии и касается достоверной идентификации бактерий рода , и может быть использована в лабораторной практике как способ с высокой дискриминационной способностью. Высокий внутривидовой уровень фенотипической изменчивости и схожий профиль ферментации углеводов у лактобацилл приводят к недостоверной идентификации данной группы бактерий классическими микробиологическими методами. В связи с чем, на первый план выходят способы идентификации бактерий рода основанные на анализе нуклеотидной последовательности генов. Данные способы обладают высокой воспроизводимостью результатов, но их дискриминационная способность напрямую зависит от выбранного генетического маркера. Наиболее близким аналогом является способ идентификации лактобацилл основанный на анализе нуклеотидной последовательности гена кодирующего 16 рибосомальную РНК (16)( С. ., . Н.//. - 1999. - . 2. -. 299- 305.). Принцип идентификации заключается в амплификации методом ПЦР фрагмента 16 гена с последующим определением его нуклеотидной последовательности, и сравнения с другими нуклеотидными последовательностями,депонированными в международных базах данных,(/) референтных штаммов лактобацилл. Часто определение нуклеотидной последовательности 16 гена используется при идентификации микроорганизмов выделенных из различных биоценозов. Так например, .с соавторами ( ,.,.,М.,.,.,.,.,- . 44. - . 223-229) идентифицировали данным способом микроорганизмы, выделенные закваски, при этом им удалось идентифицировать новый вид .. Недостаток способа основанного на анализе нуклеотидной последовательности 16 гена заключается в том, что он не позволяет идентифицировать генетически близкие виды ( . Е.,. ., Р. .16//. - 1992. - . 42, .1. - . 166170). Официально признано, что идентичность в 97 нуклеотидной последовательности 16 гена является пороговым значением видовой характеристики ( Е.,В.М.-16//. - 1994. - . 44. - . 846849). Однако, идентичность между разными видами 2 родаиногда составляет менее 0,5,например . , .и .(99.7-99.9), .и .(99.9), .и .(99.9), .и .(99.7), и .и .(99.7). Принимая во внимание это свойство, сравнительный анализ идентичности нуклеотидной последовательности рибосомальной РНК не позволяет его использовать как единственный идентификационный маркер рода, что приводит к поиску новых способ генетической идентификации с использованием анализа нуклеотидной последовательности генетических маркеров с высокой дискриминационной способностью. Важность поиска таких маркеров была отмечена также международным Комитетом по переоценке бактериальных разновидностей. В своем отчете Комитет рекомендует использовать определение нуклеотидной последовательности генов,кодирующих белки, для видовой дифференциации близко связанных( Е.,.,. М., .. .,.,М. . .,.,- .,.,. .,., . .,.-//.,. - 2002. - . 52. - . 1043-1047). Задачей изобретения является разработка способа видовой идентификации фенотипически и генетически близких бактерий родана основе анализа нуклеотидных последовательностей гена кодирующего лейцил-тРНК синтетазу. Технический результат заключается в достоверной идентификации фенотипически и генетически близких бактерий рода . Характеристика методики Принцип идентификации заключается в амплификации методом ПЦР фрагмента гена,кодирующего лейцил-тРНК синтетазу,с последующим определением его нуклеотидной последовательности, и сравнения с другими нуклеотидными последовательностями,депонированными в международных базах данных. Амплификация фрагмента гена кодирующего лейцил-тРНК синтетазу в разработанном способе осуществляется с использованием подобранных универсальных праймеров 379 - 5- 3. Условия проведения полимеразной цепной реакции Реакция ПЦР с праймерами 379 и 1297 выполняется в общем объеме 30 мкл. ПЦР смесь должна содержать 150 нг ДНК, 1 Ед.( или ее аналог),0,2 каждого дНТФ, 1-х ПЦР буфер ( и его аналог), 1,52, 10 п моль каждого праймера. Программа ПЦР амплификации включает один цикл длительной денатурации при 95 С в течение 7 минут 30 циклов 95 С - 40 секунд, 50 С- 50 секунд,72 С - 1 минута 30 секунд один цикл заключительной элонгация 7 минут при 72 С. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами Пример 1 Была изучена дискриминационная возможность разработанного способа, основанного на анализе фрагментов нуклеотидных последовательностей гена кодирующего лейцилтРНК синтетазу, в сравнении с анализом нуклеотидных последовательностей 16 гена. В исследовании было использовано ДНК 66 культур, которые были идентифицированы как представители рода . Всего было проанализировано 24 вида лактобацилл. Способы идентификации, основанные на анализе нуклеотидной последовательности 16 игенов,показали различный уровень дискриминационной способности на видовом уровне. Наименьшим процентом идентичности и соответственно высокой дискриминационной способностью обладает нуклеотидная последовательностьгена, позволяя надежно идентифицировать виды, входящие в различные филогенетические группы, а также генетически близкие между собой виды (таблица 1). Таблица 1 Идентичность нуклеотидных последовательностей анализированных генов между идентифицируемыми видами Наименования сравниваемых видов Идентичность нуклеотидных последовательностей генов 16.и . /. превышает 97 что,не позволяет их достоверно идентифицировать с использованием способа идентификации основанного на анализе нуклеотидной последовательности данного гена. В то время, как и генетически близкие повиды,так как идентичность нуклеотидной последовательностигена между данными видами не превышает 82. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ идентификации фенотипически и генетически близких видов бактерий родана основе анализа нуклеотидных последовательностей гена кодирующего лейцилтРНК синтетазу , включающий амплификацию методом ПЦР фрагмента гена, определение его нуклеотидной последовательности, отличающийся тем,что амплификацию фрагмента гена кодирующего лейцил-тРНК синтетазуосуществляют с использованием универсальных праймеров 379-5-3 1297-5-3.