Способ определения предрасположенности к рассеянному склерозу на основе тестирования полиморфизма 308 G/A гена TNFα

(51) 01 33/53 (2009.01) 01 33/50 (2009.01) 12 15/10 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ТЕСТИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА 308 / ГЕНА(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. Задачей предлагаемого изобретения является внедрение высокоточного, оперативного способа определения вероятности возникновения и развитиясреди граждан русской национальности,проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза,основанного на клинических показателях. Поставленная цель достигается тем, что для анализа полиморфизма в русской популяции Республики Казахстан -308/ тестируемого фрагмента промоторного участка генапроводится полимеразная цепная реакция (ПДРФвариант), направленная на выявление среди тестируемых лиц аллеля риска, связанного с заболеванием или с риском его возникновения.(72) Айтхожина Нагима Абеновна Мендеш Мрат шрбеклы Балмуханов Тимур Саимович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАССЕЯННОМУ СКЛЕРОЗУ НА ОСНОВЕ Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. В ряду генов, связанных с возникновением тяжелого наследственного мультифакторного аутоиммунного заболевания - рассеянного склероза стоит ген(фактор некроза опухоли), роль которого в возникновении патологии продемонстрирована в ряде мировых популяций. Рисковые генотипы и аллели различаются в зависимости от этнической принадлежности обследуемых лиц и для многонационального государства,которым является РК,учт национальных генетических особенностей при диагностикеобязателен. Наличие гетеро- и /или гомозиготного мутантного аллеля в пробе ДНК является основанием для рассмотрения тестируемого пациента, как страдающе го предполагаемым заболеванием. В результате однонуклеотидной замены основанияна А происходит нарушение в синтезе продукта гена,приводящее к нарушению функциональной активности. Тестируемый участок теряет сайт рестрикции, осуществляемой рестриктазой 19,что позволяет обнаружение искомой замены в процессе анализа. В качестве прототипа изобретения возможно использование исследований, проведенных в некоторых мировых популяциях. Так, в частности,обнаружена ассоциация//.- 1999.- .521 -.1500). Недостатком данных способов является отсутствие данных о возможности использования полиморфизма гена -альфа среди основных национальностей РК - русских и казахов. Задачей предлагаемого изобретения является внедрение высокоточного, оперативного способа определения вероятности возникновения и развитиясреди граждан русской национальности,проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза,основанного на клинических показателях. Для решения поставленной задачи использования маркеровидентифицировано два аллеля аллель(образующий при наличии сайта рестрикции фрагменты длиной в 87 п.н. и 20 п.н.) и аллель А (при отсутствии сайта рестрикции фрагмент длиной 107 п.н.). Все обследованные лица,в зависимости от сочетания данных аллелей,генотипированы как(гомозиготный по наличию сайта рестрикции),(гетерозиготный по наличию сайта рестрикции) и АА (гомозиготный по отсутствию сайта рестрикции). Носители аллеля А имеют более высокий уровень транскрипционной активности гена, чем носители предкового аллеля . Соответственно, аллель А является рисковым для лиц русской национальности, проживающих в Казахстане. Повышенная частота встречаемости аллеля А среди пациентов русской национальности коррелирует с диагнозом - рассеянный склероз,клинически подтвержденным специалистами кафедры неврологии Медицинского Университета г.Астаны и отделения неврологии Центральной городской клинической больницы г.Алматы, где проводился отбор проб крови, что является конкретным примером выполнения способа. Пример. Для анализа тестируемого фрагмента полиморфизм -308/ промоторного участка генапроводится полимеразная цепная реакция(ПЦР). Продукты реакции анализируется при помощи электрофореза в 8 полиакриламидном геле. Регистрация полученных результатов проводится с использованием гельдокументирующей системы - (фиг.). Реакцию амплификации проводят в объеме 10 мкл. Компоненты реакции 67- Н (рН 8.8), 16.6 М (Н 4)24, 0.01-20, смеси четырех деоксинуклеотидтрифосфатов (по 0.25 М каждого), 2 М 2, два праймера (по 2 рМ),ДНК-полимераза (1 ед/мкл) и 50 нг ДНК образца. Условия амплификации начальная денатурация при 95 С в течение 7 мин денатурация (95 С, 45 сек),отжиг праймеров (58 С, 45 сек) и элонгация (72 С,45 сек) - 35 циклов конечная элонгация 72 С в течение 10 мин. Последовательность прямого праймера,используемого в ПЦР 5- САААТ-3,обратного праймера 5 -ТСС ТССС ТСТТС -3. Основным преимуществом предлагаемого способа является возможность проведения достоверной оперативной диагностики на ранних стадиях и определения генетической предрасположенности к рассеянном у склероз у на современном молекулярно-генетическом уровне. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения предрасположенности к рассеянному склерозу на основе использования полиморфизма 308 / гена , отличающийся тем, что путем полимеразной цепной реакции выявляют замену основания гуанин на аденин,проводят верификацию диагноза на ранних стадиях заболевания и определяют генетическую предрасположенность к возникновению заболевания до проявления клинических симптомов среди лиц русской национальности Республики Казахстан. 2, 10 - гетерозигота 6 - гомозигота по отсутствию сайта рестрикции 1,3,5,9, 11, 12 - гомозигота по наличию сайта рестрикции М -маркеры молекулярной массы Фи г. - Электрофореграмма распределения продуктов рестрикции полиморфного участка промоторной области гена .