Способ прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания

(51) 01 33/53 (2009.01) 01 33/88 (2009.01) 01 33/48 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания. Способ прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания,включает исследование в сыворотке крови, соотношение интерферона-гамма и интерлейкина-4 (ИФН- /ИЛ 4), уровень интерлейкина-2 (ИЛ-2) и фактора некроза опухоли-(ФНО-),при значении соотношения ИФН-/ИЛ-4 менее 0,8 и снижении уровня ИЛ-2 в 3,0 раза и более, ФНО- в 2,0 раза и более прогнозируют неблагоприятное течение туберкулезного процесса.(72) Аленова Арике Хамзовна Сартаева Гульнур Шыныбековна Наубетьярова Айзада Наубетьяровна(73) Государственное учреждение Национальный центр проблем туберкулеза Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Заявка на изобретение 2004121886, кл. 01 33/53, 2005(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для прогнозирования тяжести, течения туберкулеза органов дыхания. По данным современных научных исследований в Республике Казахстан отмечается рост заболеваемости и распространенности туберкулеза среди населения. В последние годы увеличивается число больных с остротекущими и прогрессирующими формами заболевания,характеризующимися распространенностью процесса с преобладанием казеозно-некротической реакции легочной ткани с исходом в фибрознокавернозный туберкулез. В настоящее время туберкулез отличается полиморфизмом клиникорентгенологической картины заболевания,торпидным, затяжным течением, связанным в большинстве случаев с устойчивостью МВТ к противотуберкулезным препаратам. От тяжести течения туберкулезного процесса в большой мере зависит объем возникающих остаточных изменений и исход заболевания. В этой связи, представляется актуальной и своевременной разработка способа прогнозирования тяжести течения туберкулезного процесса. Известен способ прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания, включающий исследование в крови противотуберкулезных антител (ПТАТ) с помощью иммуноферментного анализа и при резком повышении титра ПТАТ на фоне лечения (от 0,32 до 1,0 ед. оп. пл.) прогнозируют неблагоприятную динамику процесса.(В.А. Стаханов, Н.А. Васильев, Д.Т. Леви, М.Л. Рухамина. Противотуберкулезные антитела у больных туберкулезом легких в процессе химиотерапии. Проблемы туберкулеза 5, 2001. с.4850). Недостатком данного способа является то, что определение уровня ПТАТ не является достаточным критерием в прогностическом плане так как, по данным литературы, у 25,8 детей, больных локальным первичным туберкулезом, ПТАТ вообще не обнаруживались (Ставицкая Н.В., 2003). Известен способ генетического прогнозирования течения туберкулеза органов дыхания, включающий исследование сыворотки крови при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), при котором проводят молекулярное типирование гена 1 и при наличии аллеля-1 01 прогнозируют резистентность к туберкулезу.(Заявка на изобретение 2004121886, МПК 01 33/53, 20.12.2005, бюл.35). Однако предлагаемый способ не позволяет судить о состоянии иммунологического гомеостаза,и уровне супрессивной направленности в реакциях противотуберкулезного иммунитета. Кроме того,осуществление генотипирования с помощью ПЦР требует наличия дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Задачей изобретения является разработка более информативного способа прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания. Техническим результатом способа является повышение информативности прогноза,определение эффективности проводимой терапии и возможность своевременной ее коррекции, что значительно сократит время пребывания пациента на больничной койке и обеспечит экономию бюджетных средств. Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания, включающем исследование сыворотки крови, отличительной особенностью, согласно изобретению является то,что в сыворотке крови исследуют уровень и соотношение цитокинов, в частности соотношение интерферона-гамма и интерлейкина-4 (ИФН-/ИЛ 4), уровень интерлейкина-2 (ИЛ-2) и фактора некроза опухоли-(ФНО-), при значении соотношения ИФН-/ИЛ-4 менее 0,8 и снижении уровня ИЛ-2 в 3,0 раза и более, ФНО-в 2,0 раза и более прогнозируют неблагоприятное течении туберкулезного процесса. Способ осуществляется следующим образом Для постановки иммуноферментного анализа производят забор венозной крови без гепарина в количестве 2-3 мл утром натощак. Определяют соотношение ИФН-у/ИЛ-4 и уровень цитокиновИЛ-2, ФНО-в сыворотке крови методом ИФА. Тестирование проводят с тест-системой Цитокин Новосибирского ЗАО Вектор-Бест. Реакцию проводят строго в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Методика проведения ИФА тест-системами Цитокин для определения уровня ИЛ-4, ИФН- ,ИЛ-2 и ФНО- следующая метод трех стадийный. При этом используют моноклональные антитела с различной эпитопной специфичностью к цитокинам,сорбированные на поверхности лунок разборного поли-стирольного планшета. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизированными антителами. Имеющийся в образцах цитокин связывается с иммобилизированными антителами. Несвязавшийся материал удаляется отмывкой. Связавшийся цитокин взаимодействует при инкубации с коньюгатом 1 (антитела к цитокину человека с биотином). Несвязавшийся коньюгат 1 взаимодействует при инкубации с коньюгатом 2(стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количество связавшегося коньюгата 2 определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена (перикиси водорода и хромогена-тетраметилбензидина). Реакцию останавливают добавлением раствора стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце цитокина. Учет результатов в плашечном формате ведут на иммуноферментном анализаторе(Италия). Время проведения анализа - 5-5,5 часа. Результаты считывают с построенной калибровочной кривой,умножив полученное значение испытуемого образца на коэффициент раститрованного 9 раз стандарта. 2 Для каждого цитокинового стандарта свои принципы раститровки. Исследование сыворотки крови больных методом ИФА на предмет содержания цитокинов ИЛ-4, ИФН-, ИЛ-2 и ФНО- дает возможность осуществить прогноз тяжести течения туберкулезного процесса,а также анализ эффективности проводимой терапии и своевременной е коррекции. Эффективность предлагаемого способа подтверждена клиническими испытаниями. Предложенным способом произведены исследования сыворотки 53 больных с распространенными формами туберкулеза органов дыхания и 30 здоровых неинфицированных детей Таблица Сравнительные данные цитокинов (ИЛ-4, ИФН-, ИЛ-2 и ФНО-) в сыворотке крови (пг/мл) у детей и подростков с распространенным туберкулезом органов дыхания Данные ИФН-ИЛ-2 ИЛ-4 ФНО-ИФН-/ИЛ 4 группа 20,33,2 398,721,3 4,40,2 5,90,3 4,6 группа 27,31,55 165,018,6 36,10,8 2,90,6 0,8 Р- достоверные изменения-0,05- недостоверные изменения --0,05 Анализ полученных данных показал, что при уменьшении соотношения ИФН- /ИЛ-4 менее 0,8 и снижении уровня ИЛ-2 в 3,0 раза и более и ФНО- в 2,0 раза и более у больных туберкулезом можно говорить о неблагоприятном течении туберкулезного процесса, у этих больных наблюдались более распространенные процессы с наличием распада, обильным бактериовыделением,в подавляющем большинстве случаев отмечалась мультирезистентная форма туберкулеза, что потребовало коррекции лечебной тактики и дополнительных назначений. Таким образом,характер изменений цитокинового профиля у больных туберкулезом соответствует распространенности процесса и является чувствительным показателем иммунологического гомеостаза, позволяющего объективно судить об уровне супрессивной направленности в реакциях противотуберкулезного иммунитета и при наблюдении в динамике прогнозировать тяжесть течения туберкулезного процесса. Клинический пример. Больная К., 16 лет, поступила в детское легочное отделение НЦПТ 28.11.06 с жалобами на сухой кашель со скудной мокротой, вялость, слабость,потливость, плохой аппетит, снижение массы тела,повышение температуры тела до 37,0 С. Из анамнеза болезни имеются 2 рубчика БЦЖ - 2 и 6 мм. Больная из очага туберкулезной инфекции тесный семейный контакт (с братом и сестрой). Брат из ИТУ, болеет МДР- туберкулезом в течении 5 лет,хроник БК. Сестра болела туберкулезом с 2002 года, в данное время наблюдается погруппе диспансерного учета. Химиопрофилактика по контакту не проводилась. Выявлена по обращаемости. Со слов больной 10.03.04 года была оперирована в городе Ташкент по поводу туберкулемы верхней доли левого легкого. Находилась на стационарном лечении в течении 1 месяца, затем выписана домой. На Д учет в РТД не встала. В течении 2 месяцев самостоятельно принимала. Через 2 года (в мае 2006 года) в связи с ухудшением состояния обратилась в РТД,где было сделано рентгенологическое обследование. 2-х кратное исследование мокроты на МБТ отрицательные. На основании обследования больная госпитализирована в ОПТД с диагнозом Инфильтративный туберкулез верхней доли левого легкого в фазе распада, БК отр. Лечилась по 2 категории ДОТС в течении 5 месяцев Н-0,2-0,3-1000 Е-0,6-0,75. Отмечалось прогрессирование туберкулезного процесса ухудшение рентгенологической картины, появилось бактериовы-деление, лекарственная устойчивость к 4 противотуберкулезным препаратам (Н-1-40-1000-5). В связи с МДР-формой туберкулеза,туберкулезного контакта с братом и сестрой,отсутствием клинико-рентгенологической динамики больная направлена в НЦПТ РК для лечения резервными препаратами. Из анамнеза жизни девочка из многодетной,малообеспеченной семьи- 5 детей (трое от 1-го брака, двое от 2-го). Мать трагически погибла,воспитывает мачеха с 6 лет. В 6 лет переболела вирусным гепатитом. Детские инфекционные заболевания отрицает. Сопутствущие заболеваниярезидуальная энцефалопатия, астеноневротический синдром с нарушением поведения. Двухсторонний хронический пиелонефрит в стадии ремиссии. У родителей нет постоянной работы. Общее состояние больной при поступлении средней тяжести. Кожа и слизистые бледные, тургор кожи снижен. Увеличены периферические лимфоузлы в 3 группах до 2-3 размера. Дефицит веса 7 кг. В легких дыхание слева жесткое,выслушиваются сухие хрипы. ЧД-20 в мин, пульс 105 уд/мин, АД-100/60 мм.рт.ст. Живот мягкий,безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. На обзорной рентгенограмме органов грудной клетки от 30.11.06 г.- левое легкое уменьшено,левый корень фиброзно изменен, подтянут кверху. На фоне плевроапикальных наслоений,интенсивных единичных очагов (С 1) в проекции С 2 определяется деформированная тонкостенная полость, С 3 гиповентилирована. Костальная плевра слева утолщена. В нижней доле слева единичные интенсивные очаги (С 6, С 9-10) на фоне усиленного 3 легочного рисунка. Справа в легком - деформация легочного рисунка в прикорневой зоне, правый корень уплотнен, в корне кальцинированные очаги. Общий анализ крови от 29.11.06 эритроцитов 3,34 х 1012, гемоглобин-92 г/л, ЦП - 0,82, лейкоцитов- 7,8 х 109, эозинофилов - 2, палочкоядерных -1,сегментоядерных - 57, лимфоцитов - 39,моноцитов - 1, СОЭ - 3-10 мм/час. Биохимия крови от 29.11.06 билирубин - 7,4 ммоль/л, трансаминаза - 0,60 ммоль/л, тимолова проба - 5,5 ЕД, сахар крови - 4,5 ммоль/л, мочевина крови - 6,1 ммоль/л, общий белок - 78 г/л. Общий анализ мочи от 29.11.06 - цвет светложелтый, реакция кислая, уд. вес- 1023, прозрачность полная, белок - 0,033, пл эп- 3-4-6, эритроциты единичные, измененные, лейкоцитов - 3-5-7, соли мочевой кислоты , слизь. Бактериоскопия мокроты при поступлениитрехкратно . Бактериологический посев при поступлении 133(исследование на лекарственную чувствительность определило- -5 мкг/мл и-1000) ИФА анализ ПТАТ - 0,425 ед. оп. пл Согласно предложенному способу прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания при поступлении определен цитокиновый профиль, который выявил снижение индекса ИФН- -/ИЛ-4 до 3,2, а также повышение ИФН- , ИЛ-4, ФНО- (ИФН 54,1 пг/мл, ИЛ-417,0 пг/мл, ФНО-- 11,8 пг/мл) и снижение ИЛ-2(238,9 пг/мл). На основании клинико-рентген-лабораторных данных установлен клинический диагноз Инфильтративный туберкулез верхней доли(С 1,С 2,С 3) левого легкого в фазе распада и обсеменения, БК. МДР форма. 4 категория ДОТС. Рецидив. Сопутствущие заболевания резидуальная энцефалопатия. Астеноневротический синдром с нарушением поведения. Двухсторонний хронический пиелонефрит в стадии ремиссии. Анемия 2 степени. В ИФА анализе ПТАТ через 4 месяца отмечается его снижение (0,173 ед. оп. пл), но при определении цитокинового профиля наблюдалась отрицательная динамика произошло снижение индекса ИФН- /ИЛ 4 до 1,7 (т.е. еще более низкое, чем при поступлении),ИФН- , ИЛ-2 и ФНО- незначительно снизились от предыдущего значения (53,7 пг/мл, 226,8 пг/мл и 9,2 пг/мл соответственно), а ИЛ-4 (32,0 пг/мл) напротив повысился Из вышеизложенного мы видим, что несмотря на незначительные клинико-лабораторнорентгенологические улучшения, ИФА анализа ПТАТ, иммуно-грамма выявила отрицательную динамику с еще большим превалированием 2 клеточного ответа, чем при поступлении. Помимо этого,исследование на лекарственную чувствительность в динамике определило- мульти- и суперрезистентность МБТ к противотуберкулезным препаратам (-5, Н-1,-40,-30, амикацин-30 мкг/мл). Таким образом, прогноз тяжести течения процесса у данного ребенка неблагоприятный. В связи с чем, проведена коррекция назначений и дополнительно к специфическому противотуберкулезному лечению было назначено патогенетическая, иммунокоррегирующая терапия. Этот пример показывает, что иммунограмма позволяет оценить направленность специфического процесса, эффективность проводимой терапии и осуществить своевременную е коррекцию, что значительно сокращает время пребывания пациента на больничной койке и обеспечивает экономию бюджетных средств. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ прогнозирования тяжести течения туберкулеза органов дыхания, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови исследуют уровень и соотношение цитокинов, в частности соотношение интерферона-гамма и интерлейкина-4 (ИФН- /ИЛ 4), уровень интерлейкина-2 (ИЛ-2) и фактора некроза опухоли-(ФНО-),при значении соотношения ИФН-/ИЛ-4 менее 0,8 и снижении уровня ИЛ-2 в 3,0 раза и более, ФНО- в 2,0 раза и более прогнозируют неблагоприятное течение туберкулезного процесса.