Экспресс-способ обнаружения и идентификации Brucella abortus в биологическом материале на основе иммунохроматографического анализа

(51) 61 39/40 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ липополисахаридного антигенаон вступает в реакцию со специфическими моноклональными антителами против липополисахаридного антигена/710, меченными частицами коллоидного золота и нанесенными на стартовую зону тестполоски, образуя комплекс липополисахаридный антигенмоноклональные антитела. Этот комплекс в свою очередь вступает в реакцию со специфическими моноклональными антителами/710, иммобилизованными в аналитической зоне тест-полоски, образуя тройной комплекс. В контрольной зоне тест-полоски нанесены поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши, благодаря чему там образуется комплекс иммобилизованные антивидовые антителамоноклональные антитела, конъюгированные с коллоидным золотом, независимо от наличия в тестируемом биологическом материале липополисахаридного антигена. Таким образом,при наличии липополисахаридного антигенав анализируемом образце биологического материала в концентрации 50 нг/мл и выше, в тестовой зоне образуются две параллельные окрашенные линии(аналитическая и контрольная). В случае отсутствия в анализируемом образце биологического материала липополисахаридного антигена в тестовой зоне образуется одна окрашенная линия (контрольная). Результаты апробации разработанного метода ИХА на основе моноклональных антител свидетельствует о возможности экспрессобнаружения и идентификациив биологическом материале с высокой чувствительностью и специфичностью,что значительно повысит эффективность диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота.(72) Ескендирова Сауле ЗиядиновнаДзантиев Борис БорисовичБызова Надежда Алексеевна Сотников Дмитрий ВасильевичЖердев Анатолий ВиталиевичБалтин Кайрат КанатовичУнышева Гульхан Бекбергеновна Булашев Айтбай КабыкешовичМуканов Касым КасеновичРаманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ЭКСПРЕСС-СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИВ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ НА ОСНОВЕ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии как экспресс - способ обнаружения и идентификациив биологическом материале. Технической задачей изобретения является разработка экспресс - способа обнаружения и идентификациив биологическом материале с использованием в качестве основного иммунореагента высокоспецифичных моноклональных антител штамма гибридомы /710. Анализируемый образец биологического материала абсорбируется поглощающим участком тест-полоски. При наличии в образце Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии как экспрессспособ обнаружения и идентификациив биологическом материале. Бруцеллез для Республики Казахстан до настоящего времени остается актуальной и нерешенной проблемой,имеющей особое социально-экономическое значение. 60 эпизоотических очагов бруцеллеза, выявленных в СНГ в течение последних лет, приходится на Казахстан. Стабильно высокий уровень заболеваемости бруцеллезом людей, обусловленный крайне напряженной эпизоотической ситуацией, и большой социально-экономический ущерб определяют особую значимость этой инфекции в общей структуре патологий Краткий обзор эпизоотической ситуации в мире по особо опасным болезням животных// Информационноаналитический обзор. - Россельхознадзор. ФГУ ВНИИЗЖ. - Владимир, 2008. - с. 58 Абуталип А.А. Эпизоотическая ситуация по особо опасным болезням животных в Республике Казахстан // 17-й Международный ветеринарный конгресс. - Москва,2009. В связи с этим крайне востребованы методы,обеспечивающие эффективную диагностику этого заболевания сельскохозяйственных животных. Своевременное выявление и идентификация возбудителя бруцеллеза в патологическом материале является актуальной проблемой, решение которой повысит эффективность противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий, направленных на искоренение инфекции. Бактериологический метод позволяет с крайне высокой достоверностью подтвердить наличие в биоматериале возбудителя. Дополнительное преимущество бактериологического метода заключается в возможности идентификации возбудителя до биовара. Данная информация крайне важна для выявления источника инфекции и разработки противоэпидемических и профилактических мероприятий, .,//.,,,.// . .. - 1998. . 36,6. -. 1819. Вместе с тем, кардинальным недостатком метода являются невысокие надежность и информативность результатов,обусловленные транзиторным характером инфекции, антибиотикотерапией, внутриклеточной локализацией микроба, возможностью наличия в исследуемом материале посторонней микрофлоры и другими факторами. Следует также подчеркнуть длительность получения результатов, значительную трудоемкость, низкую производительность метода и потенциальную опасность его применения для персонала лаборатории. Биологический метод анализа основан на избирательном накоплении возбудителя бруцеллеза в организме восприимчивых к нему лабораторных животных при парентеральном введении исследуемого материала, в том числе загрязненного посторонней микрофлорой. При работе с высоковирулентными штаммами бруцелл этот метод несколько более чувствителен, чем бактериологический,но малопригоден при исследовании материала, содержащего возбудителя с ослабленной вирулентностью. В остальном биологический метод сохраняет все перечисленные выше недостатки бактериологического метода. В качестве альтернативы бактериологическому анализу ветеринарной и медицинской наукой предложены ряд иммунологических методов,которые основываясь на использовании поли- или моноклональных антител,специфичных к возбудителю инфекции позволяют определить наличие или отсутствие патогена за короткое время. Агглютинационные тесты - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция коагглютинации(РКА), реакция латекс-агглютинации (РЛА) активно использовались для обнаружения как антигена, так и антител в зависимости от того, какой реагент связывается с носителем. Реагирующие с определяемым компонентом соединения могут быть адсорбированы на разных носителях - эритроцитах Абуталипов А. Изучение специфичности и чувствительности РИФ при выявлении бруцелл//Профилактика и меры борьбы с инфекционными и незаразными болезнями сельскохозяйственных животных в Казахстане Сб.науч.трудов.-Алма-Ата,1984.-. 13-20. Жанбырбаев М., Иванов Н.П. Получение и использование антительных эритроцитарных бруцеллезных диагностикумов в РИГА //Вестник с.-х.науки Казахстана. -1985. -5. . 66-68. Барамова Ш.А., Клименко В.А., Султанов А.А. Эффективность применения антительного эритроцитарного диагностикума в лабораторных и производственных условиях при обнаружении бруцелл,.,..//-1987121.-3.-.65-66, латекса Опалейчук И.С.,Умнова И.С., Желудков М.М. Использование реакции агглютинации латекса для диагностики бруцеллзной инфекции// Журн.микробиол. эпедемиол.иммунобиол.-1991.-7.-. 61-63. Агглютинационные тесты просты в исполнении,не требуют сложного оборудования Таран И.Ф.,Лямкин Г.И. Бруцеллез. - Ставрополь, 1996. - 173 с. Борисов В.А., Малов И.В., Аитов К.А. и др. Современное состояние проблемы бруцеллеза(лекция для практических врачей) //Журн. инфекционной патол.-2000.- 1-2. - с. 57-79. Однако по чувствительности они уступают твердофазным иммунохимическим методам. Диагностическую ценность РА снижает возможность ошибочных результатов из-за действия неспецифических факторов,вызывающих агглютинацию. Методы,основанные на использовании меченных флуоресцеином антител-реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - рассматриваются некоторыми исследователями как один из перспективных направлений детекции антигенов бруцелл в патологическом материале./.-1973.-.71.-.123-125. Кошкин Е.Н. Диагностическая ценность антибруцеллезной сыворотки крови в РИФ при бруцеллезе.//Меры борьбы с туберкулезом и бруцеллезом с.-х. животных в Казахстане. -Алама-Ата, 1986.-с. 107112. Дегтяренко Л.В., Павлова И.П., Разницына Г.В. Результаты изучения реакции иммунофлуоресценции при диагностике диссоциированных форм бруцелл.//Бруцеллез с-х. животных Сб.науч. трудов/ВАСХНИЛ.Всесоюзн.НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных.-Омск, 1989.-с. 52-55. Причем установлено, что РИФ можно использовать для быстрого обнаружения бруцелл из первичных посевов исследуемого материала, особенно при загрязнении последнего сопутствующей микрофлорой.,,.// . . . - 1988. - . 182,1. - . 18-21. Несмотря на положительные качества, РИФ мало используется для диагностики бруцеллеза. Помимо неоднозначной оценки его чувствительности, известную роль в этом сыграли такие недостатки, как ограниченная пригодность для определения растворимых антигенов,необходимость дорогого оборудования, высокая стоимость анализа. Значительные успехи в иммунодиагностике бруцеллеза были достигнуты благодаря активному развитию и разработке более чувствительного метода иммунохимического анализа, основанных на использовании меченных ферментами антител или антигенов - иммуноферметного анализа (ИФА). Возможность выявления и идентификации бруцеллезного антигена при исследовании патологического материала и объектов внешней среды с помощью различных вариантов ИФА была показана в работах многих авторов Регега ., ,-. // . 1983.- .- .601-608.,// - 1987. - .25.- 11.-.2090-2093. Маматова З.Б., Искандеров М.И. Иммуноферментный анализ для выявления бруцеллезных антигенов.//Ветеринария. - 1987. - 4. -с. 26-27. Умнова Н.С., Желудков М.М., Павлова И.П. Выявление антигенов возбудителя бруцеллеза иммуноферментным методом. // Журн. микробиол.,эпидемиол. и иммунобиол. 1987. - 9.-с.103-107. Максимальная чувствительность ИФА составила 2 х 106-2 х 107 м.к./мл при выявлении клеток бруцелл и 50-200 нг для растворимого антигена, что в 10-100 раз превышает аналогичные показатели РИФ и РПГА. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на идентификации специфических участков ДНК микроорганизма - его наиболее консервативного элемента. Для детекции бруцелл и лабораторной диагностики бруцеллеза ПЦР впервые применили .и соавт..,,, // . - 1990. - . 69,2. - . 216-227. ПЦР характеризуется высокой специфичностью. К достоинствам ПЦР следует отнести также и экспрессность получения результатов - в течение одного дня, тогда как изоляция культуры требует дней или даже недель. Развитие методов иммунологической диагностики в последние 10-15 лет показало, что наряду с увеличением чувствительности и повышением специфичности наблюдается тенденция упрощения иммунологического определения, обеспечения возможности проведения анализов во внелабораторных условиях. Немаловажную роль играет также снижение стоимости определения, что необходимо при скрининге большого количества образцов в целях массовой диагностики, локализации и ликвидации очагов инфекции. Перечисленным условиям на сегодняшний день в наибольшей степени удовлетворяет иммунохроматография. В иммунохроматографической системе все необходимые для анализа реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски, и ее контракт с тестируемой пробой инициирует движение фронта жидкости вдоль мембран, сопровождающееся специфическими взаимодействиями и окрашиванием аналитической зоны тест-полоски. Таким образом, иммунохроматографический анализ (ИХА) может быть проведен без использования каких-либо дополнительных приборов и реагентов, а его результаты зарегистрированы визуально. Этот метод диагностики обладает высокой чувствительностью,не требует сложного оборудования и хорошо подходит для проведения анализов в массовых количествах. Иммунохроматография обеспечивает возможность проведения своевременных противоэпизоотических мероприятий. Исключение необходимости посылать биологический материал в лабораторию уменьшает время постановки диагноза, которое в некоторых случаях имеет решающее значение. Методическая простота, экспрессность (10-15 мин) и чувствительность иммунохроматографии обусловила ее активное применение для решения разнообразных диагностических задач. Принцип иммунохроматографического определения специфических антигенов возбудителя того или иного заболевания, активно используется в настоящее время для разработки 3 иммунодиагностических тест - систем нового поколения. Кроме того, разработка диагностикумов нового поколения стала возможной на основе достижений современной биотехнологии гибридомной технологий, позволяющей получать моноклональные антитела (МКА).Моноклональные антитела сегодня необходимый атрибут лаборатории,производящей современные диагностические тест-системы. Преимущество моноклональных антител перед обычной поликлональной сывороткой заключается главным образом в том, что они имея специфичность к единственной детерминанте возбудителя болезни,могут быть наработаны в достаточном количестве за короткое время путем культивирования штаммапродуцента, тогда как соответствующая гипериммунная сыворотка является гетерогенной смесью иммуноглобулинов и в точности получить ее повторно невозможно. Известен способ экспресс-диагностики бруцеллеза животных на основе иммунохроматографического анализа, основанный на определении возбудителя овечьего бруцеллезав образцах молока от инфицированных бруцеллезом овец. Для разработки метода авторы использовали полученные ими методом гибридомной технологии моноклональные антитела к липополисахаридному антигену 16 М. Отсутствие перекрестной реакции с близкородственными микроорганизмами и высокие показатели имунохимической активности МКА штаммов гибридом 3 С 6 и 210 (константы связывания (аффинности) - 110-8 -2,510-9 и определение класса иммуноглобулинов (21) свидетельствует о возможности их использования в качестве иммунореагентов для разработки тестсистем. Предел детекции интактных клетокдля разработанной на основе МКА иммунохроматографической тест-системы составил 5103 м.кл./мл. Испытание диагностической эффективности ИХА-теста на 80 пробах молока,позитивных по результатам ПЦР-анализа, показало 100 совпадение данных- ,..//- 2007 - 02 Другие исследователи осуществили разработку ИХА-теста для обнаружения возбудителя бычьего бруцеллеза на основе специфических МКА, продуцируемых штаммами гибридом 1 С 9 и 4 В 8, которые также не взаимодействовали с гетерологичными микроорганизмами. Высокая специфичность и чувствительность разработанного ИХА-теста подтверждена 100 совпадением с результатами ПЦР-анализа при исследовании 70 проб сывороток крови крупного рогатого скота из неблагополучных по бруцеллезу стад,,Однако эти разработки являются интеллектуальной собственностью авторов, т.к. в качестве основного иммунореагента для конструирования ИХА -теста были использованы полученные исследователями моноклональные антитела. Технической задачей изобретения является разработка экспресс-способа обнаружения и идентификациив биологическом материале на основе иммунохроматогафического анализа с использованием в качестве основного иммунореагента полученных нами высокоспецифичных моноклональных антител штамма гибридомы /710 (инновационный патент 23494 от 15.12.2010. Бюл.12). Анализируемый образец биологического материала абсорбируется поглощающим участком тест-полоски. При наличии в образце липополисахаридного антигенаон вступает в реакцию со специфическими моноклональными антителами /710 против липополисахаридного антигена,меченными частицами коллоидного золота и нанесенными на стартовую зону тест-полоски,образуя комплекс липополисахаридный антигенмоноклональные антитела. Этот комплекс в свою очередь вступает в реакцию со специфическими моноклональными антителами/710,иммобилизованными в аналитической зоне тестполоски, образуя тройной комплекс. В контрольной зоне тест-полоски нанесены поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши,благодаря чему там образуется комплекс иммобилизованные антивидовые антителамоноклональные антитела, конъюгированные с коллоидным золотом, независимо от наличия в тестируемом биологическом материале липополисахаридного антигена. Таким образом, при наличии липополисахаридного антигенав анализируемом образце биологического материала в концентрации 50 нг/мл и выше, в тестовой зоне образуются две параллельные окрашенные линии (аналитическая и контрольная). В случае отсутствия в анализируемом образце биологического материала липополисахаридного антигена в тестовой зоне образуется одна окрашенная линия (контрольная). В разработанном нами иммунохроматографическом диагностикуме в качестве специфических антител для детекции возбудителя бруцеллеза используются высокоспецифичные моноклональные антитела к липополисахаридному антигену .- /710, что позволяет осуществлять достоверную индикацию бруцелл в биологическом материале. С использованием данной тест-системы возможно дифференцирование тестируемых проб на положительные и отрицательные (наличие или отсутствие окрашивания аналитической линии), а также оценка уровня накопления специфических антигенов, исходя из интенсивности окрашивания,что демонстрируется тест-полосками, приведенными на фиг.2. 4 Изобретение осуществляется следующим образом. Пример 1. Иммунохроматографическая тестполоска состоит из мембраны нитроцеллюлозной,мембраны стекловолоконной (подложка для конъюгата моноклональные антитела-коллоидное золото) и фильтров бумажных (подложка для пробы и адсорбирующая подложка), наклеенных на твердую основу из пластика белого цвета. На стекловолоконную мембрану тест-полоски нанесены и высушены специфические моноклональные антитела /710 против липополисахаридного антигена,конъюгированные с коллоидным золотом. На тестовую зону нитроцеллюлозной мембраны нанесены специфические моноклональные антитела против липополисахаридного антигена/710 и поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши. Тест-полоска может быть помещена в планшет из пластика листового белого цвета с прямоугольным окном для контроля окрашивания контрольной и аналитической зон и круглым окном - для нанесения пробы на бумажный фильтр - подложку для образца. Пример 2. Клетки штамма гибридомы/710 высевают в пластиковые матрасы площадью 25 см 2 по 2105 клеток в 1 мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. При культивировании гибридомы на сингенных мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатнобуферного раствора (ФБР),- 7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Пример 3. Анализируемые образцы биологического материала и иммунохроматографическая тест-полоска перед проведением анализа должны быть доведены до комнатной температуры (1825 С). Проведение анализа В чистую сухую емкость вносят анализируемый образец биологического материала. Вскрывают упаковку, разрывая ее вдоль прорези, извлекают тест-полоску и помещают ее в емкость с пробой. При использовании тест-полосок,помещенных в планшет, пробу наносят в круглое окно планшета. Результат анализа оценивают через 15-20 мин (максимально допустимое время - 20 мин). Выявление в тестовой зоне двух параллельных линий розового цвета (фигура 3, полоска 1) свидетельствует о положительном результате анализа, т.е. указывает на наличие в анализируемом образце биологического материала липополисахаридного антигена. Выявление в тестовой зоне одной верхней линии розового цвета(фигура 3,полоска 2) свидетельствует об отрицательном результате анализа, т.е. указывает на отсутствие в анализируемом образце биологического материала липолисахаридного антигена. Если ни одной окрашенной линии не образуется(фигура 3, полоска 3) или образуется только нижняя линия (фигура 3, полоска 4), результат анализа признается недействительным. При этом анализ следует повторить с использованием другой тестполоски. Пример 4. Диагностическая ценность предлагаемого способа экспресс-обнаружения бруцеллезного антигена в биологическом материале методом иммунохроматографического анализа (ИХА) была определена на 44 пробах патологического материала в сравнении с бактериологическим анализом. Таблица Результаты сравнительных исследований патологического материала с помощью бактериологического анализа и ИХА Наименование патматериала Паренхиматозные органы и лимфоузлы от больных животных, убитых с диагностической целью Содержимое желудка и паренхиматозные органы аборт-плодов Паренхиматозные органы и лимфоузлы контрольных животных По данным таблицы видно, что эффективность обнаружения бруцелл (или их антигенов) в патматериале у сравниваемых методов была различной. Культура бруцелл была выделена из 19 проб, что составляет 54,3 от общего количества исследованных, тогда как испытуемым методом не только подтверждены данные бактериологического анализа, но и дополнительно выявлено наличие бруцеллезного антигена в других образцах патматериала (31 проба или 88,5). Эффективность ИХА также доказана исследованием патматериала аборт-плодов крупного рогатого скота. Так,антигены возбудителя детектировались испытуемым методом в патматериале всех аборт-плодов, из которых бактериологическим методом была выделена культура бруцелл, что объясняется определением в данном иммунологическом тесте как цельных клеток бруцелл, так и их растворимых антигенов в исследуемом материале. Все образцы материала, взятые от контрольных животных, дали отрицательный результат как по данным бактериологического анализа, так и ИХА. Таким образом, результаты апробации разработанного метода иммунохроматографического анализа на основе моноклональных антител свидетельствует о возможности экспрессобнаружения обнаружения и идентификациив биологическом материале с высокой чувствительностью и специфичностью, что значительно повысит эффективность диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Экспресс-способ обнаружения и идентификациив биологическом материале на основе иммунохроматографического анализа, при котором все иммунореагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски,и ее контакт с тестируемой пробой инициирует движение фронта жидкости вдоль мембраны,сопровождающее специфическими взаимодействиями и окрашиванием аналитической тестполоски, отличающийся тем, что в качестве основного иммунореагента для детекции возбудителя бруцеллеза используют высокоспецифичные моноклональные антитела штамма гибридомы /710.