Способ обнаружения антигенов Mycobacterium bovis в патологическом и биологическом материале

(51) 01 33/577 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Технической задачей изобретения является повышение точности и эффективности обнаружения антигенов, которая решается за счет того, что в качестве захватывающих антител для сенсибилизации носителя (нитроцеллюлозных стрипов) используются моноклональные антитела,которые связываются со специфическими антигенами, с последующим выявлением образовавшегося комплекса,с помощью специфического пероксидазного конъюгата, активность которого проявляется хромогеном и оценивается визуально. Положительная реакция характеризуется появлением на поверхности носителя интенсивно окрашенных серо-фиолетовых точек. При отрицательной реакции носитель остается не окрашенным. Реакция должна быть положительной по отношению к контрольному антигену.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Акибеков Оркен Султанхамитович Боровиков Сергей Николаевич Шенжанов Канат Толюбаевич Сураншиев Жанболат Амреевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина 24462 Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных. Основным способом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является аллергический. Для этой цели используется сухой,очищенный ППД- туберкулин для млекопитающих,эффективность которого не отвечает современным требованиям, т.к. в некоторых случаях особенно в благополучных хозяйствах у животных на ППДтуберкулин отмечаются парааллергические реакции. Развитие перекрестных реакций у здоровых животных на инъекцию туберкулина связано с сенсибилизацией организма атипичными микобактериями,имеющими много общих антигенных эпитопов с патогенными видами микобактерий. Частота ложноположительных реакций, по данным литературы, колеблется от 1 до 3 и выше, что затрудняет определение истинной эпизоотической ситуации по туберкулезу и приводит к неоправданной выбраковке здоровых животных (Жумаш А.С, Тургенбаев К.А. Пути оздоровления хозяйств от туберкулеза крупного рогатого скота//Алматы, 2005.-с.22-27., Тургенбаев К.А. Диагностика туберкулеза животных//Алматы,2001.-с.5-12). Ни один из способов детекции микобактериальных антигенов в полной мере не отвечает требованиям в сложившейся эпизоотической ситуации по туберкулезу. Классические способы недостаточно чувствительны и длительны. ПЦР - анализ имеет очень высокую чувствительность, но нецелесообразен для массовых исследований, поскольку расходные материалы для проведения исследований очень дорогостоящи. В этой связи хорошо зарекомендовал себя иммуноферментный анализ, который отвечает практически всем требованиям Международного эпизоотического бюро. К перечню его достоинств можно отнести высокую чувствительность,специфичность. Единственным недостатком способов ИФА является использование в них поликлональных антител, что снижает их специфичность и является главным препятствием при внедрении в диагностическую практику. Поэтому результаты ИФА будут более достоверными в случае использования моноклональных антител (МКА), направленных против уникальных эпитопов бактерий,характеризующихся постоянными свойствами и доступных в неограниченном количестве. Известен способ для индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза с использованием специальной питательной среды. При этом в качестве основы питательной среды используют ферментативный гидролизат из плацентарно-эмбрионально-маточных тканей/ отходов производства мясокомбинатов/ убитых коров и свиней (См. пат. РФ,2086257, М., кл. А 61 К 39/04, опубл. 10.08.1997). Известен способ индикации микобактерий туберкулеза в воздушной среде который характеризуется тем, что пробу воздуха пропускают 2 через электрическое поле, при этом бактерии заряжаются в зоне отрицательного разряда и оседают на положительно заряженном электроде,изготовленном в виде сменного металлического поддона, покрытого жидкой питательной средой для выращивания микобактерий туберкулеза, последние культивируют в течение 2 дней, концентрируют,супернатант удаляют, а полученный осадок ресуспендируют, далее микобактерий туберкулеза определяют молекулярно-генетическим методом(ПЦР). Способ позволяет определить микобактерий туберкулеза (МБТ) в воздухе в короткие сроки (3-5 дней) (См. пат. РФ,2162709, М., кл. А 61 К 39/04,опубл. 10.02.2001). Наиболее близкой, к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту, (прототипом) является способ выявления микобактериальных антигенов с помощью реакции латекс агглютинации. Для постановки реакции агглютинации латекса,сенсибилизированного кроличьими иммуноглобулинами к микобактериям туберкулеза,используют мокроту, а в качестве лиганда контрольного латексного препарата иммуноглобулины кролика, полученные до его иммунизации микобактериями туберкулеза (См. пат. РФ,2147125, М., кл. 01 33/50, 01 33/569,опубл. 27.03.2000). Однако следует отметить, что при этом способе поликлональные кроличьи иммуноглобулины значительно снижают специфичность реакции и повышают вероятность ложноположительных реакций. Технической задачей изобретения является устранение отмеченных недостатков, повышение точности и эффективности обнаружения антигенов, которая решается за счет того,что в качестве захватывающих антител для сенсибилизации носителя(нитроцеллюлозных стрипов) используются моноклональные антитела,которые связываются со специфическими антигенами, с последующим выявлением образовавшегося комплекса с помощью специфического пероксидазного конъюгата,активность которого проявляется хромогеном и оценивается визуально. Положительная реакция характеризуется появлением на поверхности носителя интенсивно окрашенных серо-фиолетовых точек. При отрицательной реакции носитель остается не окрашенным. Реакция должна быть положительной по отношению к контрольному антигену. В результате были определены следующие оптимальные режимы постановки сэндвич варианта для обнаружения антигеновв патологическом и биологическом материале. Оптимальной концентрацией моноклональных антител, при которой происходит максимальная иммобилизация их на твердой фазе, является 5-10 мкг/мл по концентрации белка. Процесс адсорбции МКА на твердой фазе протекает активно при температуре 4 С в течение 16-18 часов в буферной системе с рН 9,5. Связывание МКА с антигеном и соединение специфического конъюгата с 24462 комплексом антителоантиген наиболее эффективно протекают при температуре 37 С в течение 1 часа. Для разведения специфического конъюгата, а также отмывки системы при постановке ИФА лучше результаты были получены при использовании забуференного физиологического раствора (ЗФР) с 0,05 содержанием твина - 20, который снижает неспецифическое связывание реагентов и,следовательно,обеспечивает наименьший фоновый сигнал реакции. Проявление ферментативной реакции следует проводить в темном месте в течение 20-25 мин. при комнатной температуре. Перед исследованием патологического материала проводили его обработку кусочек органа или лимфатического узла (2,0-3,0 г) измельчали ножницами и растирали в фарфоровой ступке со стерильным песком с соблюдением правил работы с инфицированным материалом. К растертому материалу добавляли четыре части (по объему) 1 ного формалинизированного физиологического раствора с рН 8,0-9,0. Подготовленный материал переносили в маркированные бактериологические пробирки и прогревали в кипящей водяной бане в течение 30 мин для инактивации возбудителя и разрушения его термолабильных антигенных веществ. Центрифугировали 20 мин при 2000 об/мин и надосадочную жидкость использовали в качестве исследуемых образцов. Образцы биологического материала (моча) исследовались в нативном виде. Получение моноклональных антител осуществляли следующим образом Гибридизацию клеток миелом Х 63 8.653 и иммунных спленоцитов проводили по методу . ,.в стерильных условиях с использованием 50 раствора полиэтиленгликоля. Клонирование гибридом - продуцентов МКА проводили методом лимитирующих разведении (.. .). Для тестирования использовали непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых планшетах (, Дания) иммобилизированные специфическим антигеном в концентрации 0,01 мг/мл в 0,05 М бикарбонатном буфере с рН 9,6 при 4 С в течение 18 часов. Константу связывания моноклональных антител определяли по методу .. Определение изотипов МКА проводили в реакции иммунодиффузии(РИД) со специфическими антисыворотоками к различным классам мышиных иммуноглобулинов (1,-2 ,-2 , -2 ,3,- ). Способ осуществляется следующим образом На поверхность стрипа с помощью автоматической пипетки наносят по 0,002 мл раствора моноклональных антител в карбонатбикарбонатном буфере (рН 9,5) в концентрации 5-10 мкг/мл. Затем стрипы оставляют при комнатной температуре до высыхания. Далее их помещают в 1 раствор бычьего сывороточного альбумина на дистиллированной воде для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 С стрипы отмывают четырехкратно забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05 твина-20 (ЗФР-Т). Стрипы помещают в исследуемую пробу и инкубируют при температуре 37 С 60 минут. После окончания инкубации промывают стрипы четыре раза ЗФР-Т и переносят в чашку Петри с рабочим раствором специфического конъюгата. Закрывают чашку и инкубируют при температуре 37 С 60 минут. По окончании инкубации промывают стрипы шесть раз ЗФР-Т и вносят чашку раствор хромогена. Инкубируют при 18-22 С в тмном месте 30 минут. Положительная реакция характеризуется появлением на поверхности носителя интенсивно окрашенных серо-фиолетовых точек. При отрицательной реакции носитель остается не окрашенным. Реакция должна быть положительной по отношению к контрольному антигену. Осуществление способа обнаружения антигенов(паренхиматозные органы, лимфатические узлы,моча, носовые истечения) от морских свинок,экспериментально зараженных патогенными и атипичными штаммами микобактерий. Для получения объективных данных эти же пробы были исследованы с помощью традиционных методов и в ПЦР - анализе (таблица 1). Результаты исследования проб биоматериала на туберкулез Номера Методы исследований морских Микроскопия Бактериология среда сэндвич свинок ВКГ вариант ИФА 1 В результате проведенных исследований методом ИФА были получены результаты, которые не всегда совпадали с результатами классических исследований,однако были полностью подтверждены в ПЦР - анализе. Кроме того,необходимо отметить, что разработанная тестсистема обнаруживала только микобактерии бычьего вида,что объясняется строгой специфичностью моноклональных антител а антигенам бычьего вида, использованных для сенсибилизации носителя. Другие методы,использованные в данном опыте, позволяли обнаруживать микобактерии, не определяя их видовой принадлежности,включая и представителей атипичных штаммов микобактерии. Большее количество проб, положительных в ПЦР,объясняется тем,что эта тест-система предназначена для выявления ДНК возбудителя туберкулеза без разделения на микобактерии человеческого и бычьего вида. Пример 2. Сэндвич вариант ИФА на нитроцеллюлозных стрипах был испытан в сравнении с ПЦР анализом на 68 пробах материала, взятого от 17-ти положительно реагирующих на ППД-туберкулин голов крупного рогатого скота. В качестве контроля были использованы суспензии лимфатических узлов, паренхиматозных органов и мочи от здоровых животных (таблица 2). Таблица 2 Диагностическая ценность сэндвич варианта ИФА сэндвич вариант ИФА Полимеразная цепная реакция Исследуемый материал печень легкие лимфоузлы моча печень легкие лимфоузлы моча Из таблицы 2 следует, чтоу исследуемых животных выявлены как в ПЦР 4 в патологическом и биологическом материале и сравниваемых методов была различной. Так, ПЦР анализ, исследованных,тогда как в сэндвича только 30 образцов патологического и биологического материала(44,1 ), что объясняется большей специфичностью сэндвич ИФА именно к антигенам. Лабораторные способы ИФА имеют большое значение для проведения массовых обследований патологического и биологического материала в целях ранней диагностики туберкулеза, наносящего огромный экономический ущерб промышленному птицеводству. Тест-система может найти применение в ветеринарии как официальный метод при исследованиях проб патологического и биологического материала, с целью экспрессдиагностики такой опасной для здоровья животных и человека болезни как туберкулез. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ обнаружения антигеновв патологическом и биологическом материале,включающий адсорбцию на нитроцеллюлозных стрипах моноклональных антител, отличающийся тем, что в качестве агентов детекции антигенов используют моноклональные антитела и специфический пероксидазный конъюгат.