Способ диагностики растений картофеля на вирусоносительство

(51) 01 33/569 (2006.01) 12 1/04 (2006.01) 12 1/70 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ на вирусоносительство, которая достигается за счет применения комплексной тест-системы для экспресс-диагностики растений. Способ состоит в том, что на первом этапе проводят сенсибилизацию полистирольных плат комплексом смешанных иммуноглобулинов против вирусов -,-,-,-,- на втором этапе в лунки плат вносят тестируемый образец (антиген) и на заключительном этапе вносят комплексный раствор смешанных коньюгатов против вирусов -,-,-,-,- после чего в лунки плат добавляют субстрат фермента,что приводит к образованию окрашенного продукта, при наличии одного или нескольких вирусов в исследуемой пробе. Способ может быть успешно использован в первичных звеньях семеноводческого процесса при получении исходного семенного материала, значительно снижает объемы работ по проведению ИФА,тестируемых образцов, затрат на приобретение химических реактивов и органических полимеров.(72) Швидченко Владимир Корнеевич Хасанов Вадим Тагирович Мазурок Виталий Васильевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ НА ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВО(57) Изобретение относится к области безвирусного семеноводства картофеля, в частности, к способу комплексной диагностики растений на вирусоносительство. Технической задачей предлагаемого способа является упрощение и удешевление иммунологической диагностики растений картофеля Изобретение относится к области безвирусного семеноводства картофеля, в частности, к способу комплексной диагностики растений на вирусоносительство. Известен способ электронно-микроскопической диагностики растений, который применяется для детекции вирусов при изучении болезней неизвестной этиологии, или в тех случаях, когда другие способы не дают однозначного ответа. Электронно-микроскопическую диагностику используют для контроля при очистке вирусов в приготовлении антигенов,при получении антисывороток и при регенерации меристемных растений. Чувствительность способа - 1-10 нг вируса/мл (см. Современные иммунологические методы в массовой диагностике вирусов растений. Обзорная информация, М., 1986, с.52). Недостатки способа - низкая производительность, невысокая пропускная способность, сложность и дороговизна. Известен способ индикаторной диагностики растений, суть которого состоит в перенесении предполагаемой вирусной инфекции на растения индикаторы,способные реагировать на тестируемый возбудитель специфическими симптомами. Заражение растений проводится с помощью натирания листьев соком образца или трансплантацией живой растительной ткани исследуемого образца на растение-индикатор. Широкое применение в семеноводческой практике для массовых анализов наи А вирусы нашли растения-индикаторы ТЕ-1 и А-6. Зараженность растений картофеля данными вирусами можно определить даже на отделенных листьях в течение 5-6 дней, тогда как для других индикаторов в большинстве случаев необходимо использование целых растений для анализов. Причем время протекания реакции длится около месяца (см. Л.Н. Трофимец и др. Достижения селекции и семеноводства картофеля, М., 1978, с.47-48). Недостатки - способ довольно трудоемок, длителен,низко воспроизводим и требует специальных площадей для выращивания растений-индикаторов в искусственных условиях. Известен способ серологической диагностики вирусов растений, основанный на иммунитете теплокровных животных. При введении фитопатогенных вирусов в кровь животного(антигенами). Выделяя антитела из крови животных,получают сыворотки, специфичные к тому или иному вирусу. В настоящее время выпускают диагностические сыворотки к вирусам , , , , . Сыворотки бывают моновалентными специфичными только к одному вирусу бивалентными - к двум и три-валентными - к трем вирусам. Для оценки растений на вирусоносительство, сок тестируемого растения смешивают с сывороткой, специфичной к определенному вирусу. Присутствие вируса, в результате реакции антиген-антитело проявляется в виде хлопьевидного осадка. Недостатки серологической диагностики - невозможность выявления вирусови , , низкая чувствительность анализа (100 мкг/л) не позволяет использовать его при ранней диагностике вирусов растений, так как, на практике часто требуется выявлять значительно меньшие концентрации вирусов в тканях растений (см. В.А. Шмыгля. Методика контроля и требования к качеству диагностических сывороток к вирусам и бактериям,поражающим картофель, М. 1970, с.11). Известен способ диагностики растений картофеля на основе иммуноферментного анализа(ИФА). Чувствительность данного способа составляет 1-10 нг вируса/мл. Принцип ИФА состоит в том, что с одним из компонентов комплементарной пары антиген-антитело химически сшивается фермент, другой компонент сорбируется на твердой фазе, далее проводят реакцию нейтрализации,добавляют соответствующий субстрат и определяют ферментативную активность комплекса антигенантитело, которая пропорциональна содержанию определяемого вируса в опытном образце. В настоящее время ИФА применяется в трех основных модификациях прямой метод, непрямой метод и метод двойных антител. Принцип метода двойных антител (сэндвичвариант ИФА) заключается в образовании комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами и иммуноглобулинами, меченными ферментом, с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом. Сущность прямого варианта иммуноферментного анализа состоит в том, что сенсибилизацию плат иммуноглобулинами не проводят, а антиген сорбируют непосредственно на поверхности. В лунки плат вносят иммуноглобулины, меченные ферментом лунок, с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом. Непрямой вариант иммуноферментного анализа заключается в том, что на первой стадии реакции в лунки полистирольных плат вносят антиген (вирусный препарат или сок растений), добавляют сыворотку, предназначенную для испытания, инкубируют и отмывают антитела,не образовавшие комплекс с антигенами. На второй стадии реакции в лунки плат вносят антивидовые глобулины, меченные ферментом (коньюгаты),которые вступают во взаимодействие с антителами исследуемой сыворотки. Например, если в роли испытуемого образца выступают антитела кролика,то ферментом метят антикроличью сыворотку осла или козы (см. А.Ф. Бобкова, С.Н. Чирков. Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений(обзор) // Сельскохозяйственная биология, М. Колос, 1983,5, с.32-35. О.В. Николаева. Современные иммунологические методы в массовой диагностике вирусов растений. Обзорная информация, М., 1986, с.52). Из всех известных способов, наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом), является 24461 способ диагностики растений картофеля, на основе метода двойных антител (сэндвич-вариант ИФА),который заключается в образовании комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами и иммуноглобулинами, меченными ферментом, с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом (см.,.-. . ., 1977, . 34,2, .475-483). К недостаткам известного способа следует отнести рутинную диагностику при многочисленном нанесении растительных образцов,рабочих растворов иммуноглобулинов, коньюгатов и субстратного буфера в лунки нескольких полистирольных плат, каждая из которых предназначена для тестирования растений лишь на один вирус, а также трудоемкость и большой расход органических полимеров(полистирол) и химических реактивов, и, вследствие этого, их дороговизны для проведения анализа. Технической задачей изобретения является упрощение и удешевление иммунологической диагностики растений картофеля на вирусоносительство, которая достигается, за счет применения комплексной тест-системы для экспресс-диагностики растений. Сущность предлагаемого способа раскрывается следующим примером. На первом этапе проводят сенсибилизацию полистирольных плат комплексом смешанных иммуноглобулинов, специфических к Х-, -, М-, -,А-, - вирусам, инкубацию в течение 2-х часов при 37 С и отмывание их избытка. На втором этапе осуществляют нанесение вируссодержащего раствора или тестируемого образца (антигена) в лунки плат и инкубацию его в течение 10-14 часов при 4 С. После этого проводят удаление не связавшегося антигена промыванием лунок. На заключительном этапе вносят комплексный раствор смешанных коньюгатов(антител меченных ферментом) специфических к Х-, -, М-, -, А-, вирусам и инкубируют их в течение 1 часа при 37 С,после чего коньюгаты удаляют промыванием лунок. При внесении субстрата фермента, происходит образование окрашенного продукта при наличии одного или нескольких вирусов в исследуемом образце. С целью приготовления комплексного рабочего раствора антител в равном объеме берут кроличьи специфические к Х-, -, М-, -, А-, - вирусам картофеля иммуноглобулины (жидкий концентрат в 50 глицерине с 0,01 мертиолятом натрия) и добавляют в один общий рабочий раствор, из расчета 20 мкл концентрированного раствора антител (в 50 глицерине) на 10 мл покровного буфера. 10 мл рабочего комплексного раствора антител достаточно для проведения 100 анализов. Рабочий раствор антител можно хранить не более 1 недели при 4 С. Для приготовления комплексного рабочего раствора коньюгатов берут по 20 мкл концентрированных растворов кроличьих иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена(жидкий концентрат в 50 глицерине с 0,01 мертиолятом ) и смешивают с 10 мл общего рабочего раствора буфера для проб и коньюгатов. Приготовление буферных растворов (покровный буфер, промывочные растворы, буфер для проб и коньюгатов, субстратный буфер) осуществляется,согласно стандартной методике сэндвич-варианта иммуноферментного анализа (см. Инструкция по применению иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля / Государственное научное учреждение Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха, Коренево, 2008, 7 с). Эксперимент по тестированию растений картофеля на наличие каждого из 6 вирусов, а также, комплекса вирусов был заложен в 2-х повторностях и трех вариантах(антител, меченных ферментами) , , , , , А 3) Отрицательный контроль - антителоантиген (растительный материал безвирусного растения)-антитело (прототип). Результаты тестирования с использованием поликлональной сыворотки по каждому вирусу в отдельности и в комплексе по 6 вирусам представлены в таблице 1. Таблица 1 Результаты испытания комплексного диагностикума (КД) на детекцию вирусов сэндвич-вариантом ИФА Вариант опыта Глобулины Антигены Коньюгаты Детекция вируса 1 Положительный контроль (прототип) 2 Отрицательный контроль (прототип) Как видно из таблицы 1, испытуемый анализах необходима достаточно жесткая комплексный диагностикум способен выявлять стандартизация условий, желательно чтобы вся вирусы как в отдельности, так и в серия анализов была проведена с одной партией случае смешанной вирусной инфекции. Согласно коньюгата и плат. визуальной оценке, а также данным оптической Известно, например, что платы фирмы плотности,чувствительность,созданногострадают угловым эффектом комплексного диагностикума,не уступает сенсибилизация в правом верхнем углу происходит прототипу (таблица 2, 3). Учитывая, что для хуже, чем в остальных лунках. высокой чувствительности ИФА в серийных 1 2 3 Положительный контроль (прототип) Опытный вариант Отрицательный контроль (прототип) Таблица 2 Визуальная оценка результатов иммуноферментного анализа на основе созданного комплексного диагностикума к вирусам -,-,-,-,-, В-2, В-3 - положительный контроль - детекция на вирусС-2, С-3 - комплексный диагностикум - детекция на вирус 4-2, -3 - отрицательный контроль В-4, В-5 - положительный контроль - детекция на вирус М С-4, С-5 - комплексный диагностикум - детекция на вирус М-4, -5 - комплексный диагностикум - детекция на вирус В-6, В-7 - положительный контроль - детекция на вирусС-6, С-7 - комплексный диагностикум - детекция на вирус-6, -7 - отрицательный контроль Е-6, Е-7 - положительный контроль - детекция на вирус А-6, -7 - комплексный диагностикум - детекция на вирус А-6, -7 - отрицательный контроль В-8, В-9 - комплексный диагностикум - детекция на вирусы -,-,-,-,-,С-8, С-9 - комплексный диагностикум(отрицательный контроль) Таблица 3 Оптическая плотность иммуноферментного анализа на основе созданного комплексного диагностикума к вирусам -,-,-,-,-, Примечание описание к таблице 3 см. в описании таблицы 2. Предлагаемый способ диагностики растений на 1-й плате,включающий комплексы иммуноглобулинов и коньюгатов, позволяет устранить указанные недостатки и существенно удешевить технологию тестирования. Рассмотрим фактическое снижение материальных затрат при использовании предлагаемого способа. Если учесть, что в каждой плате 96 лунок, одна из которых используется для положительного, другая лунка - для отрицательного контроля (96-294), то для проведения 1000 анализов способом-прототипом в одной повторности по каждому вирусу необходимо 11 плат (11941034), а по 6 вирусам - 66 (11 х 666). Стоимость одной полистирольной платы составляет 500 тенге. На проведение 1000 анализов уходит 66 плат - их стоимость составит при этом 33000 тенге. Тестирование же 1000 анализов предлагаемым 5 24461 способом комплексной диагностики обходится в 5500 тенге, т.е. в 6 раз дешевле. Следует также отметить, что при удалении реагентов с поверхности лунок плат и их промывании, с помощью промывочного устройства,а также при считывании результатов тестирования, с помощью спектрофотометра, в 6 раз снижаются затраты на электроэнергию. Кроме того, для индикации растений картофеля предлагаемым способом требуется минимальное количество растительного материала (до нескольких мг), что особенно важно в селекционной работе. Так,например,если для приготовления растительной пробы, тестируемой на 6 вирусов в одной повторности необходимо 0,06 г растительного материала на 600 мкл буферного раствора (из расчета 0,1 г анализируемого образца на 1 мл буферного раствора по методике), то для приготовления растительной пробы, тестируемой на 6 вирусов одновременно, достаточно 10 мг тестируемого образца на 100 мкл буферного раствора. Таким образом,при использовании предлагаемого изобретения в 6 раз снижаются объемы работ по проведению ИФА, объемы тестируемых образцов, затраты на приобретение химических реактивов,необходимые для приготовления буферных растворов и на приобретение органических полимеров. Способ комплексной диагностики на вирусоносительство может быть успешно использован при ранней диагностике меристемных растений при оздоровлении картофеля, так и на уровне серийных полевых испытаний, с целью выявления степени общей пораженности посадок картофеля вирусной инфекцией. Преимущество способа заключается в том, что новый комплексный диагностикум позволяет проводить детекцию одновременно широкого спектра вирусов картофеля, не снижая при этом чувствительности иммуноферментного анализа. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики растений картофеля на вирусоносительство, включающий образование комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами и иммуноглобулинами, меченными ферментом, с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом, отличающийся тем, что тестирование растений одновременно на вирусы ,-,-,-,-,- осуществляют сенсибилизацией полистирольных плат комплексом смешанных иммуноглобулинов, специфических к -,-,-,-- вирусам, инкубацией в течение 2-х часов при 37 С и отмыванием их избытка на первом этапе,нанесением вируссодержащего раствора или тестируемого образца (антигена) в лунки плат и инкубацией его в течение 10-14 часов при 4 С,удалением не связавшегося антигена промыванием лунок на втором этапе, внесением комплексного раствора смешанных коньюгатов (антител меченных ферментом) против вирусов -,-,-,-,-инкубированием в течение 1 часа при 37 С,удалением их с помощью промывания лунок на третьем этапе, внесением субстрата фермента,сопровождающееся образованием окрашенного продукта, при наличии одного или нескольких вирусов в исследуемой пробе на заключительном этапе.