Способ определения оксипролина в биологическом материале

3 Изобретение относится к медицине, а именно к способам оп ределения оксипролина в биологическом материале и может быть ис пользовано как экспресс метод для оценки фиброгенности различныхпьшей в эксперименте. Известен способ определения фиброгенности пыли путем подсче та в бронхиальном лаваже количества нейтрофильных лейкоцитов и альвеолярных макрофагов и по их отношению НЛ/АМ определяют степень цитотокситаности и фиброгенности гщлш.(М МВ СССР Обоснование ПДК концентрации аэрозолей в рабочей зоне, 1983) .Способ имеет ряд недостатков малочувствителен при действиинейтрофилов и макрофагов. Известен также способ определения оксигхрозшна в биологичес ком материале, включающий отбор биологического материала, програвание его при 98-1 О 0 Сохла.ж,цение, обработку смесью при 1 хлоруксусной и хлорной кислоты, отделение супернатанта, добавление к нему ПАБ, повторное нагревание смеси в течение 30 сек при 980 10006 с последующим измерением оптической плотности в полученнойпробе. Плазму крови перед внесением ТКУ нагревают 2,О 2,5 мин до 98-10000, затем охлаждают до 18-2200. ТЮ вносят в концентрации 20 совместно с 55 хлорной кислотой. Нонденсацию ведут щи нагревании смеси до 98-10000 75-80 с. а продукт конденсации, перед измерением оптической плотности, экстрагируют смесью четыреххлористого углерода и Н-бутанолаувзятого в соотношении 13 (Авторское свидетельство СССР 183 834518, М.Нл. О 01 А 33/48, 1979).Однако с помощью известного способа при действии фиброгенной пыли в эксперименте невозможно выявить начальные процессы фиброза из-за низкой концентрации гидрооксипролина в крови и моче, ЪфОМЭ ЭТОГО определение ОКСИПр 01 ШН 8 В МОЧЭ И крови дает ОЦЕНКУфункционального состояния соединительной ткани организма в целом, при любых системных поражениях, в результате чего, очень сложно4 ОТДИфферЫ-ЗЪМРОВЗТЬ за СЧЕТ ЧЕГО ИДЕТ накопление ИХ В КРОВИ И МОЧЭ.Технический результат изобретения повышение чувствительности, упрощение и сокращение времени определения оксипролина в биологическом материале.Это достигается тем, что в способе определения оксипролина в биологическом материале, включающем отбор биологического материала, прогревание его при 98100 С, охлаждение, обработку смесью трихлоруксусной и хлорной кислоты, отделение супернатанта, добавление к нему ПАБ, повторное нагревание смеси в течение ЗО сек при 98-10006 с последующим измерением оптической плотности в полученной пробе, согласно изобретению биологический материал получают путем промывания бронхов и легких, вводя в них 5 мл физиологического раствора, выделяют бронхолегочный лаваж, гомогенизируют в присутствии экстрагирующего раствора, 0,45 А/ЭБ 1 В 0,ОЕМ трисбуфере, рН 7,4, содержащего 0,2 г смеси смолы Даузкса растертый с активированным углем в соотношении 11, затем пробу центрифугируют,отделяют супернатант, осадок обрабатывают этиловым спиртом дважды,полученный экстракт объединяют с супернатантом, образеп прогревают, охлаждают и обрабатывают ТКУ и хлорной кислотой, отделяют осадок, 1 мл супернатанта титруют 6 н 1 аО по фенолфталеину, доводят объем пробы, до 2 мл и добавляют к ней 2 мл НЗЗО 4 и 0,5 млнагревают 80 сек при 98-ШОООС, охлаждают до комнатной температуры и регистрируют оптическую плотность при-БЭЕНМ в кювете с толщиной слоя 10 мм.Определение фиброгенности пыли осуществляется путем определения общего оксипролина в биологическом материале. У людей в клинических условиях получают биологический материал при бронхоскопи. Уживотных в экспериментальных условиях под гексаналовым наркозом в отпрепарированную трахею вводится металлическая канюлякрнической формы, которая фиксируется лигатурой на трахее. Шприцом вводится 5 мл стерильного физиологического раствора непосредст 19725 венно В ЛЭГКИЭ И отсасывается обычным МЕДИЦИНСКИМ ШПРИЦОМ.Пплученный бронхолегочный лаваж гомогениэировали с 3 мл экстрагирующего раствора содержащем 0,45.ь/аС 1 в 0,05 М трио буфере рН 7,4 в течение 10 минут, затем пентрифугировадш в течение 30 мин. при 3000 оборотов в минуту. прибавляли 0,2 г смеси смолы Дауэкс, растертой с активированным углем 11, для уменьшения вероятности получения красного хромогена в реакции с другими аминокислотами. переманивали, оставляли на 2.0 мин., затем центрифугировали при 3000 об/имн. в течение 20 клин. Осторожно сливали супернатант,к осадку добавляли 4 мл охлахщенного этилового спирта, тщательно перемешвадш, отстаивали в течение 10 мин. Центрифугировалъх 10 мин. при 3000 об/мин. Полученный супернатант сливали в пробиркуМ. Осадок промывали дважды спиртом (по 1 мл) и экстракт сливали в пробирку 111. Полученный супернатант нагревали 2-2,5 мин при 98 10000, охлалщазш до комнатной температуры и добавляли 0,2 мл ТКУ и 0,4 мл 55 хлорной кислоты. Содержимое тщательно перемешивали и центрифугировалш при 3000 об/мин.20 мин. Осторожно отбирали 1 мл прозрачного супернатанта в мерные пробирки и ти-гровацш бн На СН по фенолфталеину и доводили объем до 2 мл. К 2 мл нейтрализованной смеси добавляли 2 мл 112504 и 0,5 мл 10 раствора парадиметиламинобензальдегида в 96 этаноле. Пробу тщательно перемешивали и нагревали 75-80 сек. при 98-10000 и охлалдцадш до комнатной температуры. Оптическую плотность полученных проб измеряют на ФЭНе при длине волны 558 нм в кюветах с толщиной слон 10 мм. Существенными отличиями данного изобретения является то, что биологический материал получают путем промывания бронхов и легких,вводя в них 5 мл физиологического раствора, выделяет бронхолегочный лаваж, гомогенивируют в присутствии экстрагирующего раствора,0,45 ЫаС 1 в 0,05 М трио-буфере, рН 74 содержащего 0,2 г смесидля уменьшения вероятности получения красного хромогена в реакцииВ результате избирательной экстракции коллагенов происходитболее полный выход свободным и непрочно связанных между собоймолекул коллагена, что имеет большое диагностическое значение для оценки начального фиброзного процесса непосредственно в очаге по ражения бронхолегочной ткани (в эксперименте и в клинических исс ледованиях). Предлагаемый способ характеризуется высокими метрологическимипараметрами, простотой воспроизводимости, минимальной затратой вре мени. Для оценки фиброзных процессов в легких использовали воздей ствие пли. В качестве исходного образца был взят кварц как тандарт при излучении фиброгенности пыли, представляющй собой высокодисперсный порошок со средним эквивалентным диаметром частиц 2 мкм. Удельная поверхность составляла 7,4 мг/г, содержание свободной двуокиси кремния равнялось 99,1.В оптах использовались беспородные крысы самцы массой 150180 г, которым интратрахеально вводилась пыль в дозе 50 мг в 1 мл физиологического раствора. Через 2 и 4 недели проводит исследо ВЗНИЯ, Степень СИЛИКОТИЧЭСКОРО СКЛВРОЗВ. ОЦВНИВЗЛЭЮЬ ПО весу ЛЕГКИХ, лимфоузлов и по содержанию оксипролина в легких. В процессе выполнения способа было подобрано мнимальное ко личество жидкости для хорошей воспроизводимости. Экспериментально подобрали соотношение смолы и актиированного угля (11) для более полноо осаждения белка, мешающего его определенъпп.УСтаН 0 влен режим элюирования оксипролина при выделении его из белковых гидро ЛИЭ. Экспериментальные исследования ПОКЗЗЭЛИ, ЧТО на определениеоксипролина в бронхолегочном лаваже уходит 2-3 часа. При опреде лении общего оксипролина по способу прототипа, уходит время В пре делах 48 ч. Пример осуществления способа.