Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов, стоящих под контролем индуцибельного промотора rd29A Arabidopsis thaliana, с использованием энхансеров трансляции в системе in vivo

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Достигаемый технический результат повышениеуровня экспрессии гена интереса,вызванного взаимодействием регуляторных последовательностей индуцибельного промотора 29 и энхансерных 5-нетранслируемых последовательностей (5-НТП), расположенных в составе рекомбинантных ДНК-конструкций. Предлагается при конструировании рекомбинантных кассет использовать последовательность индуцибельного промотора гена 29 изв комбинации с последовательностями 5-НТП для повышения уровня синтеза рекомбинантных белков в системеприблизительно в 2,7-3,4 раза. Заявленный способ может быть использован как модельная система для изучения работы индуцибельных генов,а также генов транскрипционных факторов растений, способных связываться с -элементом промотора 29. Полученные в ходе разработки изобретения агробактериальные штаммы,содержащие рекомбинантные ДНК с геном, который помещен под контроль индуцибельного промотора 29 и различных 5 НТП, могут быть использованы для дальнейшей трансформации растительных тканей с целью получения ГМ растений,устойчивых к абиотическому стрессу.(72) Искаков Булат Кудайбергенович Писаренко Алена Михайловна Карпова Оксана Владиславовна Наргилова Руфина Мустафаевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ,СТОЯЩИХ ПОД КОНТРОЛЕМ ИНДУЦИБЕЛЬНОГО ПРОМОТОРА 29,С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭНХАНСЕРОВ ТРАНСЛЯЦИИ В СИСТЕМЕ(57) Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов, стоящих под контролем индуцибельного гена 29, с использованием энхансеров трансляции в системеотносится к области биотехнологии растений, молекулярной биологии и генетической инженерии. Изобретение относится к области биотехнологии растений, молекулярной биологии и генетической инженерии. Одним из направлений современной биотехнологии растений является создание трансгенных растений, продуцирующих белки медицинского назначения,такие как терапевтические и диагностические антитела, а также съедобные вакцины. Для увеличения эффективности синтезируемого белка встает проблема повышения уровня его продукции в трансгенных растениях. Для обеспечения максимального уровня синтеза белка в системеиуспешно применяют 5 нетранслируемые последовательности (НТП) вирусных или клеточных мРНК, которые являются энхансерами процесса трансляции. Известными энхансерами являются последовательность 5-НТП мРНК вируса табачной мозаики (ВТМ), 5-НТП мРНКвируса картофеля и 5-НТП гена глутамин синтетазы 1.239-247). Присутствие этих последовательностей перед стартовым кодоном приводит к усилению трансляции чужеродных кодирующих последовательностей в разных клетках и бесклеточных системах. Для дальнейшего повышения уровня экспрессииирекомбинантных генов их кодирующие последовательности ставят под контроль сильных конститутивных промоторов,например 35 промотора вируса мозаики цветной капусты или 35 , в сочетании с 5- НТПэнхансерами ( .., 2,-//. - 2006. . 18. .1292-1309...2//. - 2007. - . 50. - . 5469.. ..(1)1//. - 2001. .126. .109121). Последовательности промоторов несут различные регуляторные области сайты посадки рибосом, АТ- и ГЦ- богатые участки,необходимые для узнавания факторов 2. Доказано, что именно взаимодействие энхансеров трансляции с промоторными областями приводит к усилению уровня транскрипции в несколько раз. Недостатками воздействия конститутивного промотора в ГМ растениях является то, что его использование приводит к изменению фенотипических и физиологических признаков,что отрицательно отражается на жизнеспособности растительного организма в целом под контролем конститутивного промотора происходит постоянная экспрессия трансгенов. Если же в качестве трансгена используется ген какого-либо транскрипционного фактора, придающий такой полезный признак,как устойчивость к биотическому или абиотическому стрессу, то часто возникает необходимость синтеза белка, обеспечивающего защиту от последствий стресса, в нужном количестве только при возникновении неблагоприятных условий окружающей среды. Для многих генов растений избежать этих последствий или свести этот эффект к минимуму позволяет применение индуцибельных промоторов ( М.. А 129-//. - 2004.45 (3). 346-350.,.,М.,0070453552,- 2006-0416. Патент РФ 2128225 от 27.03.1999). В отличие от конститутивных активность индуцибельных промоторов не зависит от эндогенных факторов,их активность контролируется факторами окружающей среды, стимулами извне организма или клетки. Промотор гена 29 является индуцибельным, в его промоторной области был идентифицирован -действующий регуляторный элемент, ответственный за индукцию экспрессии этого гена в ответ на засуху, засоление и холод. Эта последовательность(/),названная -элементом (от), обнаружена также в промоторных областях многих других генов,индуцируемых засухой и холодом. Одним из транскрипционных факторов,способным взаимодействовать с - элементом, является представитель семейства белков /2 (от, активация которого происходит в условиях температурного стресса. Цель предлагаемого изобретения - на примере двух трансгеновипоказать эффективный способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в системес использованием сочетания индуцибельного промотора 29 и энхансеров трансляции пяти разных вариантов (5 р 1, 53, 5,5 и 5). Поставленная цель достигается путем выполнения нескольких последовательно выполняемых задач- создание рекомбинантных ДНК-кассет,содержащих помимо кодирующей последовательности генаилипод контролем индуцибельного промотора 29 все необходимые компоненты для регуляции и усиления экспрессии данного гена в условиях- встраивание рекомбинантных ДНК-кассет по сайтам рестрикции в состав агробактериального вектора, с помощью которого ДНК-кассеты способны войти в состав генома растительных клеток- доставка бинарного агробактериального вектора, содержащего рекомбинантный ген под контролем всех регуляторных элементов, в клетки агробактерий с целью использования их для трансформации растительных тканей- анализ временной экспрессии трансгенов в системе. Пример 1. Этот пример описывает процесс клонирования рекомбинантной кассеты, несущей ген -глюкуронидазыпод контролем индуцибельного промотора 29. Для клонирования последовательности индуцибельного промотора 29 использовали метод ПЦР с участием праймеров (сайты рестрикции выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) 29 5--3, (30) 29 5--3 (30). Первый праймер использовали в качестве смыслового, второй - в качестве антисмыслового олигонуклеотида. Последовательности праймеров подбирали с помощью компьютерного анализа промоторной последовательности гена 29 из(973635.1). Реакцию проводили с участием очищенного препарата тотальных ДНК, выделенных из листьев. В результате ПЦР был амплифицирован ДНК-фрагмент размером около 1 тпн. Далее ДНК-фрагмент очищали и обрабатывали рестриктазамии Ва с целью образования липких концов. Полученный легкий фрагмент использовали в реакции лигирования. В качестве тяжелого фрагмента брали тяжелый ДНК-фрагмент исходной рекомбинантной ДНК, полученной ранее в лаборатории белка и нуклеиновых кислот (ЛБНК) ИМБиБ, содержащей кассету 35- 53-- 3- -и порезанной теми же рестриктазами. Компоненты кассеты и последовательность терминатора гена нопалинсинтетазы ( были взяты изначально из плазмидного вектора 221502128.1. Телом рекомбинантной ДНК являлся бинарный агробактериальный вектор рСАМВ 1 А 2300234315.1. Легкий и тяжелый фрагменты использовали в реакции лигирования. После трансформации клеток Е.штамма 5 лигирующей смесью были отобраны клоны,содержащие последовательность промотора 29 в составе исходной рекомбинантной ДНК между сайтами рестрикциии . В результате электрофореза в агарозном геле продуктов рестрикции и ПЦР-анализа были отобраны ДНК 1,содержащие нуклеотидную последовательность промотора 29. Схематичное изображение полученной ДНК 1 представлены на рисунке 1. В ходе реакции секвенирования и компьютерного анализа было показано совпадение нуклеотидной последовательности вставки с последовательностью промотора 29 из(подчеркнуты последовательности -элемента и -,соответственно) Фиг.1 Схематическое представление рекомбинантной ДНК 1, содержащий кассету 29-53- -3-. Далее с помощью метода электропорации с участием ДНК 1 произведена трансформация штамма 2260 и получены агробактерии, несущие в своем геноме рекомбинантную кассету 29-53- 3-. Пример 2. Этот пример представляет результаты сравнительного анализа индукции экспрессии репортерного генас помощью транскрипционного фактораСравнительный анализ проводили с помощью метода вакуумной инфильтрации с участием двух видов агробактериальных штаммов. Для инокуляции листьев табака использовали суспензию клеток, состоящую из смеси разбавленных ночных культур агробактерий двух штаммов. Первый штамм, содержащий ДНК-эффектор, разбавляли до 0,7-0,85 о.е. при О 600 (смотри таблицу 1), второй штамм, содержащий ДНК-репортер, разбавляли до 0,2 о.е. В качестве ДНК-репортера использовали ДНК 1,которая несла кодирующую последовательность гена . В качестве эффекторных плазмид использовали рекомбинантные ДНК, содержащие кассеты 35- 5-НТП -- 3- -и полученные ранее в ЛБНК (указаны в колонке-содержащие в таблице 2). Как видно из таблицы 2, эффекторные ДНК-конструкции отличались только своими 5-НТП. Таблица 1 Условия проведения экспериментов по вакуумной инфильтрации Оптическая плотность агробактерий (О 600),использованных в эксперименте (о. е.) Время, которое листья находились в условиях вакуума (мин.) 5 7 7 Таблица 2 Обозначение бактериальных штаммов и конструкций, использованных для проведения агроинфильтрации в паре с ДНК 1 (фиг.1) Обозначение штамма агробактерий АБбез и/ф Обозначение ДНК-кассет, находящихся в составе генома агробактериального штамма-содержащие (репортер) 1- содержащие (эффектор) нет штамма нет штамма 29-53--335-5-1-3-нет кассеты 29 А-53- -3 нет штамма 29-53--329-53- - 3 35-5-1-3-29-53- -335-5-А 1-3-29-53--335-5-А 1-3-29-53--335-53-1-3-29-53--335-5-1-3- Таблица 3 Полные нуклеотидные последовательности различных энхансерных 5-НТП (в скобках указана длина в нуклеотидах) Название 5-НТП 5 р 53 Полная нуклеотидная последовательность 5 --3 Последовательности всех использованных нами 5-НТП представлены в таблице 3. Источники их происхождения были следующими. Варианты 5 р и 5 были любезно предоставлены Д.Р. Галли.,отдел биохимии,Университет Калифорнии). Варианты 53 и 5 АМ были синтезированы первый в ЛБНК, второй - фирмой . Вариант 5 был получен на базе ЛБНК по той же схеме, которая указана выше для клонирования последовательности промотора 29 в плазмидный вектор. Ранее было установлено,что последовательности 5, 53, 5 и 5 обладают способностью повышать уровень трансляции мРНКв разной степени. Вакуумную инфильтрацию листьев табака проводили согласно следующим условиям. Ночную культуру агробактерий выращивали на среде ЛурияБертани, содержащей 100 мкг/л канамицина. 3-4 листа табака погружали в суспензию смеси агробактерий, помещали в эксикатор и проводили вакуумную инфильтрацию в разных режимах с помощью водоструйного насоса (таблица 1). Листья споласкивали стерильной водой и выкладывали на стерильные фильтры, смоченные ММА-средой,инкубировали 2 дня при 25 С, затем перекладывали на свежую среду ММА, содержащую цефотаксим 500 мкг/л. Образцы для анализа брали с 3 по 7 день и замораживали при -70 С. Для количественного анализа образцов замороженную ткань размалывали стеклянной палочкой до состояния порошка и гомогенизировали в 100 мкл экстракционного буфера (50 мМ 24,7,0, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ -меркаптэтанола, 0,1 саркозила, 0,1 Тритона Х-100). Пробы центрифугировали 15 мин. при 16 000 , супернатант переносили в новые пробирки. Количество белка в 20 мкл каждой пробы замеряли согласно методу Брэдфорда. Для определения -активности брали по 20 мг тотального белка из каждой пробы, объем реакционной смеси доводили до 20 мкл, добавляли по 10 мкл субстратного буфера (1 мг/мл 4 метилумбелиферил -- глюкуронида в экстракционном буфере) и инкубировали 30 мин. при 37 С. Реакцию останавливали, добавляя 20 мкл пробы к 2 мл 0,2 М 2 СО 3, и замеряли флюоресценцию при 455 нм,используя возбуждающий свет с длиной волны 365 нм. Статистическую обработку вели попарно относительно варианта АБ-. Достоверные результаты (Р 0,05) получены в вариантах 5,5, 5 р, 53, 5 и . Результаты представлены на фиг.2 в виде гистограммы. Согласно рисунку 2 экспрессия геназависит от времени инкубации эксплантов и является максимальной на 3-5 день, а минимальной- на 6-7-ой в зависимости от вариантов конструкций. Конструкции АБ -и рСАМВА 2300,которые являлись отрицательными контрольными вариантами, показали результаты -активности на уровне фона, как и ожидалось. Вариант без и/ф, как видно из рисунка, дает минимальное значение экспрессии гена по сравнению со всеми отрицательными вариантами контролей. Это объясняется тем, что в отличие от вакуумной инфильтрации, когда происходит проникновение агробактерий внутрь всех клеток листовой пластины и межклеточное пространство, в случае обычной инокуляции агробактерии проникают только в места повреждения листа в ходе эксперимента. Сравнение экспрессии всех вариантов образцов проводили по отношению к варианту (3). В случае использования (3) (или ) для инокуляции брали только один штамм агробактерий,содержащий ДНК-репортер(разведение ночной культуры агробактерий до 0,2 о.е). В результате анализа минимальное действие эффектора было получено в варианте 53. Обозначения по осиданы согласно таблице 1. 5-НТП 1153 соответствует 5-НТП 3. Фиг.2 - Результаты экспрессии генав результате индукции продукта гена 1,стоящего под контролем различных вариантов 5 НТП. Хотя на 4-ий день и было получено резкое усиление экспрессии гена(в 3,1 раза по сравнению с вариантом ), но этот эффект был нестабилен и резко снижался уже на следующий день. Наилучший результат показал вариант 5,усиление экспрессии достигало максимального эффекта на 4-й и 7-й день не только по сравнению с контрольным вариантом(в 3,4 раза и 3,1 раза,соответственно), но и по сравнению с другими вариантами ДНК- эффекторов. Более детальное рассмотрение -активности для этого варианта показало положительную динамику происходит стабильное усиление экспрессии генас 3-его по 7-ой день. Варианты ДНК-эффекторов с 5-НТП 5, 5 р и 5 показали также преимущество при экспрессии гена по сравнению с вариантом , но динамика - активности у них отличается друг от друга. Если при использовании варианта 5 происходило стабильное долговременное усиление-активности, то вариант 5 АМУ показал эффект плавного нарастания экспрессии, которое достигает максимума на 5-й день, и такого же плавного снижения экспрессии с 5-го по 7-ой день. Ранее нативная лидерная последовательность размером в 17 пн, входящая в состав 5- НТП рекомбинантной ДНК 5 р, никаких энхансерных свойств в результате трансляциине проявляла. В данном же случае вариант конструкций 5 р показал достаточно эффективную временную экспрессию в листьях табака максимум зарегистрирован уже на 3- й день,затем - плавное падение экспрессии, на 7-ой день уровень -активности оставался уже не максимальным, но еще достаточно высоким (в 2,7 раз по сравнению с ). Таким образом, нами сделаны следующие основные выводы 1. Белок-продукт экспрессии гена 1 обладает способностью запускать трансляцию кодирующей последовательности гена, стоящего под контролем промотора 29 (т.е. ген кодирует белок, который является активным в системе). 2. Клонированная нами нуклеотидная последовательность промотора 29 из представляет собой активный индуцибельный промотор,содержащий все необходимые элементы для экспрессии генов рекомбинантных белков. 3. Все пять вариантов 5-НТП являются энхансерами трансляции -белка в разной степени и могут использоваться с разными целями в качестве усилителей процесса трансляции рекомбинантных белков в системе. Пример 3. Этот пример описывает схему клонирования последовательности гена 1 под контроль промотора 29. Клонирование проводили по тем же сайтам рестрикциии Ва, используя тот же самый легкий 29 А-фрагмент (смотри фиг.1), что и в примере 1. В качестве тяжелых фрагментов использовали ДНК-фрагменты исходных рекомбинантных ДНК, содержащих ген 1 под контролем промотора 35(смотри таблицу 2). В результате в составе бинарного агробактериального вектора рСАМВ 1 А 2300 были получены рекомбинантные ДНК, содержащие кассеты 29 - 5-НТП 1 - 3-с различными вариантами 5-НТП. Полученными вариантами рекомбинантных ДНК были трансформированы клетки 2260 и получены пять видов 5 штаммов агробактерий. Присутствие всех компонентов клонированных вариантов кассет в геноме агробактериальных клеток было доказано с помощью ПЦР-анализа и реакцией рестрикции. Полные нуклеотидные последовательности промотора 29 и гена 1 были получены в результате реакции секвенирования. Таким образом,с использованием индуцибельного промотора гена 29 изпоказано, что экспрессия гена глюкуронидазыувеличивается в 2,73,4 раза в разные промежутки времени и с различной стабильностью в зависимости от вида энхансера. Заявленный способ повышения уровня работы трансгенаможет быть использован как модельная система для изучения работы индуцибельных генов растений, а также генов транскрипционных факторов, участвующих в сигнальной трансдукции при стрессовом воздействии на растения и способных связываться с-элементом промотора 29, если ген интереса клонировать на место тена 1. Комбинирование различных 5 - НТП с известным трансляционным усиливающим эффектом в сочетании с индуцибельным промотором гена 29 может обеспечить после воздействия стресса увеличение уровня синтеза любого другого белка совместимого с растительным организмом, что позволит его наработать в достаточном количестве, что является важным для создания биологических вакцин. Агробактериальные штаммы,содержащие рекомбинантные ДНК с геном 1, стоящие под контролем индуцибельного промотора 29 и различных 5 - НТП, могут быть использованы для дальнейшей трансформации растений и получения сортов, устойчивых к абиотическому стрессу. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов, стоящих под контролем индуцибельного промотора 29, с использованием энхансеров трансляции в системе,включающий создание экспрессионных ДНК-конструкций с размещением перед кодирующей областью рекомбинантного гена энхансерной 5-НТП, встраивание рекомбинантных ДНК-кассет в состав бинарного агробактериального вектора под контроль конститутивного промотора,доставку полученных агробактериальных векторов внутрь клеток агробактерий, анализ временной экспрессии трансгенови 1,отличающийся тем, что действие энхансерных 5 НТП используют в сочетании с последовательностью индуцибельного промотора гена 29 из.