Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в прокариотических организмах с использованием 5′-нетранслируемой последовательности (5′-НТП) Y-вируса картофеля.

(51) 12 15/67 (2011.01) 12 15/18 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ микроорганизмов, молекулярной биологии и генетической инженерии. Достигаемый технический результат повышение уровня экспрессии целевого белка,опосредуемый регуляторной последовательностью,расположенной в 5-нетранслируемой последовательности рекомбинантных конструкций нуклеиновых кислот. Предлагается при конструировании рекомбинантных кассет, использующихся для экспрессии генов в прокариотических организмах, помещать перед кодирующей областью гена 5-НТП -вируса картофеля, состоящую из 185 н.,для повышения уровня экспрессии целевых белков. Данная нуклеотидная последовательность, находясь в 5-нетранслируемой последовательности гена целевого белка, способна повышать уровень экспрессии белка в 792 раза по сравнению с контролем и в 2 раза по сравнению с уровнем экспрессии с канонической последовательности(72) Искаков Булат Кудайбергенович Низкородова Анна Сергеевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ ОРГАНИЗМАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 5-НЕТРАНСЛИРУЕМОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ(57) Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в прокариотических организмах с использованием 5-нетранслируемой последовательности (5-НТП) -вируса картофеля относится к области биотехнологии Изобретение относится к области биотехнологии микроорганизмов, молекулярной биологии и генетической инженерии. Для получения высоких уровней экспрессии полипептидов в прокариотических клетках необходимы не только сильные транскрипционные промоторы, генерирующие большие количества матричных РНК (мРНК), но и сайт(ы) связывания рибосом , обеспечивающие эффективность трансляции мРНК. У большинства прокариотических организмовпредставляет собой богатый пуринами регион в 5-9 нуклеотидах перед стартовым кодоном. Это так называемая последовательность.,.. // .- 1975.-. 254.- . 34-38 комплементарна региону на 3-конце 16 рибосомальной РНК (рРНК). Фактически во всех векторах для экспрессии полипептидов как для лабораторных, так и для промышленных нужд используются варианты последовательности,20080113405,- 2005-05-17,7399620,- 2006-03-155422275, 1993-12-08. Последовательность - обеспечивает стабильную экспрессию большинства полипептидов. Недостатком данной последовательности в качестве энхансера трансляции является необходимость подбора расстояния до стартового кодона для каждого индивидуального гена для обеспечения наибольшей экспрессии. В качестве энхансера трансляции у прокариот известна последовательность, состоящая из первых 100 нуклеотидов 5-нетранслируемой последовательности (5-НТП) гена 10 бактериофага Т 7, 5232840,- 1993-08-03. Недостатком данной последовательности является намного более низкий уровень экспрессии полипептидов по сравнению с канонической последовательностью -. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в прокариотических системах (на примере .) до уровня сравнимого с усилением экспрессии, обеспечиваемым последовательностью -. Поставленная задача достигается путем помещения трансляционного энхансера перед кодирующей областью гена, при этом в качестве трансляционного энхансера используют нуклеотидную последовательность 5-НТП геномной РНК (гРНК) -вируса картофеляштамма О 890349.1, состоящую из 185 нуклеотидов. Данную последовательность помещают в 5-НТП мРНК-конструкций непосредственно перед кодирующей областью рекомбинантного гена для повышения уровня его экспрессии в прокариотических системах. ДНК-фрагмент, содержащий в своем составе последовательность 5-НТП гРНК , может быть синтезировани встроен по сайтам 2 рестрикции перед кодирующей областью различных рекомбинантных генов в ДНК-конструкции,позволяющие осуществлять экспрессию рекомбинантных геновидля повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов. Пример 1. В качестве примера приводится способ клонирования последовательности 5-НТП гРНКперед репортерным геном, и оценки энхансерного эффекта этой регуляторной последовательности на экспрессию рекомбинантного генав клетках Последовательность 5-НТП гРНК(рисунок 1) клонируют в экспрессионный вектор рЕТ(создан на основе плазмиды фирмырЕТ 23 с и содержит промотор и терминатор транскрипции бактериофага Т 7, линкерный участок,включающий сайты эндонуклеаз рестрикции и , репортерный ген ) между последовательностью промотора бактериофага Т 7 и генапо сайтам эндонуклеаз рестрикциии. Реакцию рестрикции проводят в течение 4-х часов при 37 С реакционная смесь содержит по 0,1 ед./мкл эндонуклеаз рестрикциии 50 нг/мкл ДНК 33 мМ трис-Ас (рН 7,9) 10 мМ 66 мМ КАс 0,1 мг/мл . Лигирование обработанных эндонуклеазами рестрикциииДНК-фрагмента с векторной ДНК рЕТ- проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т 4. Реакционная смесь содержит 66 мМ трис- (рН 7,6) 6,6 мМ 2 10 мМ ДТТ 0,066 мМ АТР 50 нг/мкл векторной ДНК, 20 нг/мкл ДНК вставки и 0,1 ед/мкл Т 4 ДНК-лигазы. Инкубацию проводят при температуре 4 С в течение 16 часов. Лигазную смесь обессоливают на диализном нитроцеллюлозном фильтре 0,025 в течение 30 минут и используют для электропорации компетентных клеток . штамма Есо-10, которые затем высаживают на агаризованную питательную среду Лурия-Бертани , содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Скрининг колоний проводят после 16 часов инкубации при 37 С выделяют препараты плазмидной ДНК и проводят их ПЦР-анализ на наличие последовательности 5 НТП гРНК . Плазмидой -, несущей 5-НТП гРНКперед последовательностью гена , проводят трансформацию клеток . экспрессионного штамма -21(3). Затем клетки высаживают на агаризованную питательную среду , содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Скрининг колоний проводят после 16 часов инкубации при 37 С выделяют препараты плазмидной ДНК и проводят их ПЦР-анализ на наличие последовательности 5-НТП гРНК . Экспрессия белка в клетках . проводится следующим образом. Клоны,содержащие исследуемые плазмиды, высеваются с чашек не старше 4-х недель в ночную культуру в 1 мл среды следующим образом. К 20 мкл водного раствора,содержащего 30 мкг тотального клеточного белка добавляется по 40 мкл экстракционного буфера,смесь инкубируется 30 мин на 37 С. По окончании инкубации к образцам добавляется 6 мкл 2 мМ(4-метил-умбеллиферилглюкуронид), с последующей инкубацией в течение 5 мин на 37 С. По 40 мкл смеси добавляется к 2 мл стоп-буфера(0,2 М 2 СО 3). Измерение количества образовавшегося 4(4-метилумбеллиферон) проводится против стоп-буфера на минифлюорометре фирмыпри поглощении с длиной волны 365 нм и эмиссии с длинной волны 460 нм. Измерение концентрации белка в препарате проводят стандартным методом по . Единица активности фермента определяется стандартно, как 1 нМ субстрата, переводимого в продукт за 1 мин на 1 мг белка. 5-АААТТААААС ААСТСААТАСААААСАСТСАТТТАААТСАТТТСТСТТАААТААТТТСАТС АСТТССААССССТСА-3 Рисунок 1. Последовательность 5-НТП гРНК вируса картофеля. Таблица 1 Эффективность экспрессии генадля конструкций, несущих разные 5-НТП, в клетках . при культивировании об/мин. По достижении клетками оптической плотности 60019, ночная культура разбавляется свежей средой , содержащей 1 глюкозы и 100 мг/мл ампициллина, до 5 мл общего объема. Для индукции синтеза Т 7 РНК-полимеразы добавляется(изопропил-тиогалактозид) до конечной концентрации 1,5 мМ. После добавленияклетки выращиваются в течение 1-го часа при 37 С с частотой шейкера 120 об/мин. Выделение тотального растворимого клеточного белка проводится по окончании инкубирования клетки центрифугируют в течение 5 мин на 5000 об/мин при 4 С клеточный осадок ресуспендируется в экстракционном буфере (50 мМ 4,7,0, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 10 мМ 2, 0,1 , 0,1 тритон Х-100) в соотношении 110 по отношению к массе осадка. Суспензия замораживается в жидком азоте, после чего быстро оттаивается на термостатируемом шейкере в режиме 37 С и 1400 об/мин в течение 5 минут. Далее проводится центрифугирование в течение 15 мин на 25000 при 4 С. Эффективность экспрессии определяют флюорометрически по активности фермента ,который является продуктом трансляции экспрессии. Измерение активности глюкуронидазы в препарате белка проводят 4) Конструкция 1) Значение -активности, нМ/мин/мг 2) Степень повышения экспрессии 3) 2116 1 0,5510-8 169772285 792 0,2510-3 86921839 405 Примечания 1) конструкция - является исходной плазмидой без энхансера, - несет 5-НТП гРНК , -последовательность - 2) значения представлены в виде, гдезначение среднего арифметического,стандартное отклонение 3) повышение экспрессии вычислялось по отношению к уровню экспрессии исходной плазмиды - 4) Уровень значимости,соответствующий фактическому - критерию, рассчитывался для данных значений по отношению к значениям - как двухвыборочный -тест с неравными дисперсиями и односторонним распределением. Таким образом, при помещении 5-НТП гРНКперед последовательностью рекомбинантного гена экспрессионных плазмид эффективность экспрессии репортерного гена в клетках Е.со увеличивается по сравнению с без-энхансерной плазмидой в 792 раза. В то же время эффективность экспрессии белка с плазмиды, несущей 5-НТП гРНК , почти в 2 раза выше эффективности экспрессии с плазмиды, несущей классическую последовательность -. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов в прокариотических организмах с использованием 5-нетранслируемой последовательности (5-НТП) -вируса картофеля,включающий помещение в экспрессионные конструкции нуклеиновых кислот перед кодирующей областью гена энхансерной последовательности, отличающийся тем, что в качестве энхансерной последовательности используют 5-НТП -вируса картофеля 5