Способ получения рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса лейкоза крупного рогатого скота р24 путем плазмидной экспрессии гена в клетках Escherichia coli

(51) 12 15/24 (2011.01) 12 15/74 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Белок нуклеокапсида вируса лейкоза крупного рогатого скота р 24 является диагностически важным антигеном вируса. Данный антиген активно используется в качестве маркера по диагностированию заболеваний крупного рогатого скота. Получена экспрессионная система на основе сконструированного плазмидного вектора,содержащего ген капсидного белка вируса лейкоза крупного рогатого скота р 24 рЕТ-28 а/р 24, и клеток штамма(3), которая продемонстрировала хорошую способность к экспрессии гетерологичного белка р 24. Отработаны основные параметры непрямого варианта иммуноферментного анализа для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием полученного рекомбинантного белка р 24. Чувствительность и специфичность иммуноферментной тест-системы на основе р 24 антигена составила 100.(72) Хасенов Бекболат Бауржанович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО НУКЛЕОКАПСИДНОГО БЕЛКА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Р 24 ПУТЕМ ПЛАЗМИДНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА В КЛЕТКАХ(57) Изобретение относится к генетической инженерии,молекулярной биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано в изготовлении диагностических наборов,использующих взаимодействие антиген-антитело. Изобретение относится к генетической инженерии,молекулярной биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано в изготовлении диагностических наборов использующих взаимодействие антиген-антитело. Традиционно в серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота используют иммуноферментные тест-системы, основанные на использовании как рекомбинантных, так и нативных 51 и 30 антигенов вируса, выделенных из клеток почки эмбриона овцы. Однако технология с использованием нативных белков вируса лейкоза крупного рогатого скота обладает рядом недостатков, связанных с низкой специфичностью подобных тест-систем и возможностью возникновения перекрестной реакции с антителами против вируса диареи крупного рогатого скота. Широкое распространение получили тестсистемы на основе рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Однако процедура получения и очистки рекомбинантного 51 антигена достаточно трудоемкая и затратная(, 2004). Белок нуклеокапсида вируса лейкоза крупного рогатого скота - р 24 также является диагностически важным антигеном вируса. Данный антиген активно используется в качестве маркера по диагностированию заболеваний крупного рогатого скота. Использование предложенной технологии рекомбинантных ДНК позволяет экономически выгодно и в короткие сроки получать капсидный белок р 24 для использования в иммуноферментных тест-системах. Задачей изобретения является разработка способа получения капсидного белка р 24 вируса лейкоза крупного рогатого скота. Задача достигается в несколько этапов 1. Создание рекомбинантного штамма продуцирующего капсидный белок вируса лейкоза крупного рогатого скота р 24 методом трансформации штамма(3) плазмидным вектором рЕТ-28 а/р 24. Ген р 24, синтезированый согласно нуклеотидной последовательности из(914764.1),интегрировали в экспрессионный плазмидный вектор рЕТ-28 а по сайтам рестрикцииипод контроль промотора РНК-полимеразы бактериофага Т 7. Полученная генно-инженерным способом плазмида кроме целевого гена р 24 несет ген 2, обеспечивающий устойчивость к антибиотику канамицину. Компетентные клетки штамма(3) трансформировали вектором рЕТ-28 а/р 24 методом электропорации. Трансформированные клетки вносили в обогащенную среду и инкубировали при интенсивном встряхивании в течение 60 мин при температуре 37 С. Далее культуру высевали на твердую агаризованную среду, содержащую антибиотик канамицин (50 мкг/мл) в качестве селекционного маркера. Рост колоний проводился при температуре 37 С в течение 16 часов. 2 Полученные колонии-трансформанты проверяли на наличие вектора рЕТ-28 а/р 24, одну из них наработали в культуре. Культуру проверяли на способность продуцировать белок р 24, и заложили на криосохранение при -80 С. Полученный штаммпродуцент(3)/-28/24 депонировали в Депозитарии ТОО Казахский научноисследовательский институт перерабатывающей и пищевой промышленности,регистрационный номер, присвоенный коллекцией В-342. 2. Наработка и хроматографическая очистка белка. Для наработки белка замороженную культуру рекомбинантного штамма вносили в бульон Луриа-Бертани, содержащий антибиотик канамицин(50 мкг/мл) и инкубировали при интенсивном встряхивании при температуре 37 С до достижения середины логарифмической фазы роста. После чего для индукции РНК-полимеразы бактериофага Т 7, находящегося под контролем промотора 5, вносили изопропилтиогалактопиранозид. После 2-16 часовой инкубации клетки собирали, лизировали методом ультразвукового соникирования,отделяли водорастворимую фракцию центрифугированием и выделяли белок р 24 методом металлохелатной хроматографии на ионах никеля 2 с использованием колонки 1( ). Эллюирующим агентом служил имидазол в концентрации 150 мМ. Полученный таким образом белок замораживали и хранили при температуре -80 С. Молекулярная масса полученного рекомбинантного аналога нуклеокапсидного белка р 24 соответствует 26,1 кДа. Полная аминокислотная последовательность насчитывает 238 аминокислотных остатков Н Наработанный белок в препаративном количестве передали в лабораторию иммунохимии и иммунобиотехнологии Национального центра биотехнологии РК, где на основе полученного рекомбинантного антигена р 24 отработали основные параметры непрямого варианта иммуноферментного анализа для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Также оценивали чувствительность и специфичность иммуноферментной тест-системы на основе р 24 антигена,которая составила 100. Данные результаты свидетельствуют о высоком потенциале иммуноферментного анализа на основе полученного рекомбинантного р 24 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Технический результат - предложен способ получения капсидного белка р 24 с помощью метода рекомбинантных ДНК. Белок р 24 используется в качестве антигена при постановке серологических реакций для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в экспериментальных и полевых условиях. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса лейкоза крупного рогатого скота р 24 путем плазмидной экспрессии гена в клетках, отличающийся тем,что используют рекомбинантный штамм(3)/-28/24.