Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота

(51) 61 39/12 (2006.01) 12 7/02 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота,включающий культивирование вируссодержащей культуры на ростовой среде, отделение культуральной жидкости с последующем ее концентрированием, в качестве исходного материала используют штамм-0351 (КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота, репродуцированный в перевиваемой вируссодержащей культуре клеток почек эмбриона овцы , выращивание которой проводят на ростовой среде Игла,содержащей 10 эмбриональную телячью сыворотку, 100 мкг/мл линкомицина и 300 мг глютамина, по окончании формирования клеточного монослоя ежедневно в течение 5 дней собирают надосадочную ростовую среду и культивирование продолжают в аналогичной свежей питательной среде,содержащей до 5 эмбриональной телячьей сыворотки, концентрирование вируса лейкоза проводят осаждением на ПЭГ-6000 до конечной концентрации 20 с последующим диализом в целлофановых полумембранных мешочках при температуре 20 С в течение суток.(72) Бахтахунов Юлдаш Хевизович Барамова Шолпан Аузаровна Жусамбаева Слукыз Исагуловна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза из вируссодержащей культуры для серологической диагностики болезни в реакции иммунодиффузии в агаровом геле. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в разработке экономичного и технически доступного способа получения специфического и стабильного препарата антигена. 21185 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза из вируссодержащей культуры для серологической диагностики болезни в реакции иммунодиффузии в агаровом геле. Известен способ, включающий культивирование вируссодержащей культуры на ростовой среде,отделение культуральной жидкости с последующем ее концентрированием Патент Российской Федерации 2185854, кл.0133/569, 2001. Недостатком данного способа является дефицитность используемых реактивов и длительность процедуры исследования. Задачей изобретения является сокращение процесса получения активного и специфичного вирусного антигена для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в разработке экономичного и технически доступного способа получения специфического и стабильного препарата антигена. Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота,включающий культивирование вируссодержащей культуры на ростовой среде, отделение культуральной жидкости с последующем ее концентрированием, в качестве исходного материала используют штамм-0351 (КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота, репродуцированный в перевиваемой вируссодержащей культуре клеток почек эмбриона овцы , выращивание которой проводят на ростовой среде Игла,содержащей 10 эмбриональную телячью сыворотку, 100 мкг/мл линкомицина и 300 мг глютамина, по окончании формирования клеточного монослоя ежедневно в течение 5 дней собирают надосадочную ростовую среду и культивирование продолжают в аналогичной свежей питательной среде,содержащей до 5 эмбриональной телячьей сыворотки, концентрирование вируса лейкоза проводят осаждением на ПЭГ-6000 до конечной концентрации 20 с последующим диализом в целлофановых полумембранных мешочках при температуре 20 С в течение суток. Штамм вируса лейкоза крупного рогатого скота(-)0351 (КазНИВИ), используемый для накопления биомассы вируса лейкоза получают путем репродукции его в поддерживаемой в лабораторных условиях хронически продуцирующей вирус лейкоза перевиваемой культуре клеток почки эмбриона овцы . Указанный штамм вирус лейкоза крупного рогатого скота депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научноисследовательский институт ветеринарии(КазНИВИ). Штамм вируса лейкоза крупного рогатого скота( - )0351 (КазНИВИ) Штамм получен из культуральной жидкости перевиваемой клеточной линии почки эмбриона овцы , адаптированной к лабораторным 2 условиям культивирования, путем последовательных множественных пассажей, а также селекции клонов вируса и репродукции в приведенной культуре клеток. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм-0351(КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота является этиологическим агентом болезни лейкоза крупного рогатого скота. Он присутствует в организме инфицированных животных в непродуктивном состоянии. Вирус культивируется в лейкоцитах больного лейкозом крупного рогатого скота, в различных перевиваемых клетках, которые постоянно продуцируют вирус. Наибольшее распространение в мире получила перевиваемая линия клеток- . В культивирование его вирус активно размножается и хорошо накапливается. Эта линия используются для биохимических, морфологических и серологических исследований. Высокие концентрации вируса в культуральной суспензии обуславливают возможность получения из них биологических препаратов с высокими иммунобиологическими параметрами и повышенным содержанием вирусных антигенов в единице объема. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток почки эмбрионов овцыиспользуют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛА- и 10 телячье эмбрионалной сыворотки, для культивирования вируса на этой культуре клеток в составе данной среды уменьшают концентрацию сыворотки крови до 5. Культивирование фибробластов и вируса в них осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус лейкоза крупного рогатого скота ВЛКРС,относится к семейству ,подсемейства(онкорновирусы), который имеет род онкавирусы типа С. Род онкорновирусов типа С имеет три подрода млекопитающих, птиц и рептилий. Все представители онковирусов опухолеродны, имеют наружную липидсодержащую мембрану, существуют в геноме клетки хозяина в форме ДНК-провируса и распространяется вертикально не инфекционным, а генетическим путем подобно обычным клеточным генам. Вирионы типа С (диаметр около 100 нм) имеют сферическую форму,крупную(74-80 нм) центрально расположенную сердцевину. Культуральные свойства штамм 0351 (КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота репродуцируется и накапливается в перевиваемой вирус-продуцирующей культуре клеток почек эмбриона овцы , свободных от патогенных микроорганизмов в титре 18-132 и выше в РИД. В указанных титрах штамм 0351(КазНИВИ) в фибробластях накапливается после 2-3 кратного последовательного пассирования 100-150 тыс.кл/мл. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных фибробластов почки овец проявляется через 72-96 ч после перевивки и охватывает все его площади в период между 96-120 ч.(КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота в организме привитых КРС, овец, коз и кроликов стимулирует образование вируснейтрализующих (25 2) и преципитирующих (2-3 2) антител. Патогенные свойства. Штамм-0351(КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота не патогенный. У привитых животных не иммунных к вирусу лейкоза вызывает образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител, которые формируются на 15-90 сутки. Иммуногенные свойства. Штамм-0351 (КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота репродуцированный в культурев дозе от 5 х 107 клетокпри подкожном или внутримышечном введении у животных вызывает пожизненное образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител, которые формируются на 15-90 сутки. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма 0351 (КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота сохраняются при культивировании в культурена протяжении 200 пассажей. Сохраняемость. Штамм-0351(КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 4 С в течение 30 суток, минус 18-20 С - 3 месяцев, минус 40 С - 6 месяцев, а в жидком азоте в течение 5 лет(срок наблюдения). Лиофилизированный антиген вируса лейкоза в смеси со стабилизирующей средой,содержащей среду Игла 80, сахарозу 10,эмбриональной сыворотки 20 сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 24 месяцев. Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для серологической диагностики болезни осуществляется следующим образом. Пример 1. На основе штамм-0351(КазНИВИ) ) вируса лейкоза крупного рогатого скота изготавливают вирусный антиген для серологической диагностики лейкоза КРС. Для чего вирус репродуцируют в монослойной культуре почки эмбриона овцы , выращенных стационарным способом в среде ИГЛА-,содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл линкомицина и 300 мг глютамина. Для культивирования используют клетки с полным плотным монослоем без каких либо дегенеративных изменений, полученным в течение 72-96 ч культивирования после высева клеток в стеклянные сосуды. Для перевивки на новый цикл наработки антигена вируса лейкоза клетки снимают со стекла смесью растворов 0,02 версена и 0,25 трипсина или химопсина в соотношении 91, ресуспендируют в выше указанной среде. Засевают в стеклянные сосуды и инкубируют в термостате при температуре 36-37 С в течение 4-7 дней, со сменой среды через каждые 1 или 2 суток. Посевная концентрация клеток составляют 100-150 тысяч на 1 мл ростовой среды. При таком способе культивирования формирования монослоя происходит на 3-4 сутки. После формирования монослоя из сосуда с монослойной культурой клеток сливают ростовую вируссодержащую среду, вносят поддерживающую,содержащую в составе среду ИГЛА- и до 5 эмбриональной телячьей сыворотки. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение 48-120 ч, с ежедневным сбором вируссодержащей культуральной жидкости до полного развития цитопатогенного действия вируса на всей площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса сосуд с клетками встряхивают, сливают культуральную жидкость и вместе с ранее собранными вирусными материалами подвергают замораживанию при температуре минус 20 С и ниже. Затем содержимое сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 37 С при периодическом механическом встряхивании. Содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют и из них очищают и концинтрируют вирус путем осаждения на полиэтиленгликоле с молекулярной массой 6000(ПЭГ-6000) и диализа на полумембранных мешочках. Пример 2. Полученную культуральную жидкость осветляют центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 20-30 минут и проводят 50-100 кратные концентрирование вируса из культуральной жидкости следующим образом. К 100 мл вируссодержащего материала добавляют ПЭГ-6000 до конечной концентрации 20 и более процентов и натрий хлор до 0,5 М. Смесь интенсивно встряхивают в течение 5-10 минут и оставляют при 4 С в течение 12-16 часов. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут при 4 С. Часть надосадочной жидкости удаляют,оставшейся части с осадком продолжают концентрировать методом диализа. Для чего смесь культуральной жидкости с ПЭГ вносят в целлофановые полумембранные мешочки, концы их плотно завязывают и помещают в стеклянную посуду. Для ускоренного диализа сверху засыпают ПЭГ-6000, из расчета 20 и более процентов к общему объему исследуемой жидкости и выдерживают при комнатной температуре в течение 12-14 часов. В результате чего из трубки путем диализа жидкая часть культуральной суспензий выходят, а вирусы остаются. Образовавшийся осадок ресуспендируют боратным буферным раствором в объеме 1100 и используют в качестве антигена ВЛКРС. Для сохранения стерильности к полученным антигенам добавляют мертиолят(0,01), азид натрия (0,0 2), гентамицин (0,03) и разливают во флаконы и хранят при 4 С или в замороженном виде при температуре минус 20 С до исследования на активность и специфичность. Пример 3. Для определения активности антигены разводят 12 и 14 и исследует в РИД со стандартными специфическими преципитирующими сыворотками (СПС). С этой целью готовят 1,0 раствор агара в боратном буферном растворе. Раствор 3 21185 расплавленного агара разливают равномерным слоем в чашки Петри. После застывания агара специальным штампом вырезают лунки. В центральную лунку вносят СПС. В две периферические, диаметрально противоположные лунки - испытуемый антиген (без разведения). В две периферические - антиген разведенный 12 и 14. Оставшиеся две периферические лунки заполняют физиологическим раствором. Чашки закрывают крышками и инкубируют при температуре 20-26 С в течение 4872 часов. Через 48 часов в геле формируются линии преципитации, расположенные между центральной и периферическими лунками, в которые внесены антигены антиген (без разведения) и антиген в разведении 12-14, что указывают на активности и специфичности антигена. Таким образом, применение предложенного способа позволит культивировать и накапливать вируссодержащего материала в необходимом объеме для приготовления иммунодиагностических и профилактических препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота,включающий культивирование вируссодержащий культуры на ростовой среде, отделение кудьтуральной жидкости с последующим ее концентрированием,отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют штамм-0351(КазНИВИ) вируса лейкоза крупного рогатого скота,репродуцированный в перевиваемой вируссодержащей культуре клеток почек эмбриона овцы , выращивание которой проводят на ростовой среде Игла,содержащей 10 эмбриональную телячью сыворотку, 100 мгк/мл линкомицина и 300 мг глютамина, по окончании формирования клеточного монослоя в течение 5 дней собирают надосадочную ростовую среду и культивирование продолжают в аналогичной свежей питательной среде, концентрирование вируса лейкоза проводят осаждением на ПЭГ-1 6000 до конечной концентрации 20 с последующим диализом в целлофановых полумембранных мешочках при температуре 20 С в течение суток.