Способ репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота

(51) 12 7/00 (2006.01) 12 1/93 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота включает культивирование инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота перевиваемой линии культур клетокв питательной среде Игла-МЕМ с 10-ной нормальной сывороткой крови телят, предварительно обработанной 20 -ным полиэтиленгликолем с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, затем через 72 ч после формирования сплошного монослоя осуществляют смену среды на бессывороточную питательную среду Игла-МЕМ,содержащую дополнительно 20 ЕД/мл инсулина и 3 г глюкозы из расчета на 10 л среды. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в получении в достаточном объеме вируса лейкоза крупного рогатого скота с высокой иммунологической активностью используемого для изготовления диагностических и профилактических средств.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Мададов Малакша Фашанович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна(56) Валихов А.Ф. Серологическая диагностика лейкоза крупного рогатого скота путем выявления антител к вирусоспецифическому антигену онкорновируса типа С. М. Колос, 1977, с. 372(54) СПОСОБ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии в частности к способам репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота для получения целевой биомассы с высокой иммунологической активностью. 20552 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и клеточной биотехнологии в частности к способам репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота для получения целевой биомассы с высокой иммунологической активностью. Известен способ репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота,включающий культивирование лейкоцитов больных лейкозом животного скота,получение субкультуры первичной и вторичной генерации (Валихов А.Ф. Серологическая диагностика лейкоза крупного рогатого скота путем выявления антител к вирусоспецифическому антигену онкорнавируса типа С // Лейкозы и злокачественные опухоли животных. М. Колос, 1977, с. 372). Недостатком известного способа является то, что в первичной культуре лейкоцитов крупного рогатого скота невозможно получить концентрированный в достаточном объеме вирус лейкоза крупного рогатого скота необходимый при производстве диагностических и профилактических биопрепаратов. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в получении концентрированного в достаточном объеме вируса лейкоза крупного рогатого скота с высокой иммунологической активностью используемый для изготовления диагностических и профилактических средств. Способ репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота включает культивирование инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота перевиваемой линии культур клетокв питательной среде Игла-МЕМ с 10 -ной нормальной сывороткой крови телят,предварительно обработанный 20-ным полиэтиленгликолем с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, затем через 72 ч после формирования сплошного монослоя осуществляют смену среды на бессывороточную питательную среду Игла-МЕМ,содержащую дополнительно 20 ЕД/мл инсулина и 3 г глюкозы из расчета на 10 л среды. Способ осуществляется следующим образом. Хранившиеся при темпераутре минус 196 С перевиваемую линию клетокразмораживают при температуре 37 С и клеток переносят в стерильные сосуды с ростовой средой из расчета 100 тыс кл/см 3. Сосуды с клетками инкубируют при температуре 37 С до образования сплошного равномерного монослоя. Затем для пересева клеток монослой снимают с помощью растворов 0,25 трипсина и 0,2 версена в соотношении 19, для чего раствор в объеме 5 см 3 вносят в сосуд с клетками и поверхность промывает в течении 3 минут и после сливания вновь вносят свежую порцию растворов трипсина и версена в объеме 3 см 3, после этого сосуд покачивая легким движением распределяет раствор по монослою и ставят на термостат с температурой нагрева 37 С на 30 минут,в течении данного времени монослой просматривают под микроскопом до разбухание и 2 отслоении клеток от поверхности стекла. Затем после отслоения клеток в сосуд вносят свежую порцию ростовой питательной среды в объеме 10 см 3 содержащей 10 сыворотки крови телят и собирают в стерильные флаконы. Полученные клетки центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин и температуре 4 С. После центрифугирования проводят подсчет клеток в камере Горяева. Клетки пересевают в матрасы Тартаковского из расчета 100 тыс. кл/см 3 и объем ростовой среды доводят до 150 см 3 содержащей 10 сыворотки крови телят, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Сосуды с клетками инкубируют при температуре 37 С. За формированием равномерного сплошного монослоя клеток наблюдают в течение 48-72 часов, просматривая матрасы под большим увеличением микроскопа. После формирования сплошного монослоя для получения второй генерации, клеток пересевают согласно вышеописанной методике. Для этого монослой клеток трехкратно промывают подогретой до 37 С раствором Хэнкса, после чего вносят растворы 0,25 трипсина и 0,2 версена, после снятия монокультуру ее ресуспендируют в питательной среде Игла-МЕМ содержащий 10 нормальной сыворотки крови телят обработанный 20 полиэтиленгликолем и перевивают в другие матрасы в соотношении 13 для получения культуры второй генерации. После формирования монослоя производят смену ростовой среды на бессывороточную, содержащую в своем составе инсулин - 20 ЕД/мл и глюкозу - 3 г на 10 л среды. Матрасы инкубируют в термостате при температуре 37 С на 48-72 часа. За этот период в монослое отмечаются синцитиальные клетки, что указывает на репродукцию вируса лейкоцитов крупного рогатого скота. На 10-12 сутки после пересева клеток матрасов с первой и второй генераций замораживают при температуре минус 20 С и оттаивают при 4 С и собирают культуральную жидкость в стерильные стеклянные сосуды. Полученную биологическую массу вируса лейкоза крупного рогатого скота используют для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Применение данного способа репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота, позволяет культивировать и накапливать вируссодержащий материал в достаточном объеме для приготовления диагностических и профилактических биопрепаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота, включающий культивирование лейкоцитов больных лейкозом животного скота,получение субкультуры первичной и вторичной генерации, отличающийся тем, что для получения биомассы вируса используют культивирование инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота перевиваемой линии культур клеток 20552 среде Иглас 10-ной нормальной сывороткой крови телят,предварительно обработанной 20-ным полиэтиленгликолем с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, затем через 72 ч после формирования сплошного монослоя осуществляют смену среды на бессывороточную питательную среду Игла-МЕМ, содержащую дополнительно 20 ЕД/мл инсулина и 3 г глюкозы из расчета на 10 л среды.