Способ иммобилизации ацетилхолинэстеразы

(51) 12 11/00 (2006.01) 12 11/14 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области химической энзимологии и может быть использовано при химической иммобилизации ферментов, содержащих карбогидратную часть, а также целых клеток и клеточных компонентов. Описывается способ иммобилизации ацетилхолинэстеразы на кремнеземных носителях,модифицированных 3-Н 2-фенилбороновой кислотой, путем взаимодействия между карбогидратной частью фермента и дигидроксиборильными группами носителя, в результате чего образуется прочный боронат-диольный комплекс в условиях проявления максимальной активности фермента.(72) Бектенова Гульнара Амантаевна Быкова Людмила Николаевна Чинибаева Нуржан Сарсенбаевна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт химических наук им. А.Б.Бектурова Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр наук о земле,металлургии и обогащения Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Шаповалов Ю.А., Гладышев П.П. и др. Иммобилизация ацетилхолинэстеразы на аминированных углях и силохромах глутаральдегидным 20553 Изобретение относится к области химической энзимологии и может быть использовано при химической иммобилизации ферментов гликопротеинов, а также целых клеток и клеточных компонентов,например,при создании чувствительных элементов биосенсорных систем на их основе, которые могут использоваться в клинической диагностике, экологическом мониторинге объектов окружающей среды, биоскрининге новых соединений и в других областях биотехнологии. Холинэстеразы широко используются в составе электрохимических сенсоров, предназначенных для определения необратимых ингибиторов фосфорорганических и карбаминатных пестицидов и ядов нервно-паралитического действия (зарин,заман). Начиная со второй половины 90-х годов,интерес к применению холинэстераз возрос в связи с потребностью определения ряда лекарственных препаратов, а также растительных токсинов(соланин и его метаболиты). Другое важное направление развития холинэстеразных сенсоров использование генетически модифицированных продуцентов, синтезирующих как традиционные белки, так и холинэстеразы с измененной пептидной последовательностью. Это позволяет решать ряд разнообразных задач, в том числе снижение себестоимости активных препаратов фермента,направленное изменение чувствительности модифицированных холинэстераз к определенным ингибиторам (фосфорорганическим и карбаминатным пестицидам), удобство иммобилизации с использованием специальных носителей. Известны способы иммобилизации ацетилхолинэстеразы (АХЭ) глутаральдегидным методом на неорганических (- ,,. . . . - 1978. - . 9,9. - . 685-689,,. . - 1979. - .57,10. - . 1200-1203.). В современной химической энзимологии для иммобилизации ферментов широко используются методы ковалентной иммобилизации через функциональные группы белковой матрицы,которые могут приводить к изменению ее нативной конформации и потере каталитической активности фермента. Для ферментов-гликопротеинов имеется возможность осуществить ковалентную пришивку через полисахаридную часть фермента, не входящую в его активный центр. В этом случае 2 вероятность потери каталитической активности фермента уменьшается. Наиболее близким аналогом является способ иммобилизации АХЭ с помощью глутарового альдегида на поверхности силикагеля. (Шаповалов Ю.А., Гладышев П.П., Ескараева Р.А., Сармурзина А.Г.,Тазетдинова Г.Г. Иммобилизация ацетилхолинэстеразы на аминированных углях и силохромах глутаральдегидным методом. - В сб. Биологически активные вещества - Алма-Ата Наука, 1989. -Ч.2.-с.41-49.). Силохром обрабатывали водным раствором глутарового альдегида,промывали дистиллированной водой, фосфатным буфером, а затем производили связывание фермента. С помощью перистальтического насоса по капиллярам, через термостатированную колонку(4 С), заполненную аминированным силохромом прокачивали 5 мл 2 раствора глутарового альдегида, а затем раствор АХЭ с концентрацией 4,8 мг/мл и активностью 11,5 Е/мл. После прохождения через колонку, реагенты возвращались в колбу с исходным раствором. Недостатком данного метода является изменение нативной конформации белковых макромолекул в процессе иммобилизации и, как следствие снижение каталитической активности ферментов, а также невысокая стабильность иммобилизованных препаратов. Иммобилизованная ацетилхолинэстераза инактивируется в течение 30 суток. Задачей настоящего изобретения является разработка метода и оптимизация процесса иммобилизации ацетилхолинэстеразы на различных носителях путем подбора подходящих спейсеров на основе бороновых кислот и оптимальных условий для образования стабильного боронатдиольного комплекса и максимального сохранения и проявления активности иммобилизованных форм фермента. Поставленная задача решается предлагаемым способом иммобилизации ферментов, включающим активирование кремнеземного носителя и последующую пришивку фермента к активированному спейсером носителю, в котором в качестве спейсера используют бифункциональные бороновые кислоты, имеющие более низкие константы ионизации по дигидроксиборильной группе. Это позволяет проводить иммобилизацию АХЭ в мягких условиях в фосфатном буферном растворе при рН 7,5-8,0, что соответствует рНоптимуму действия АХЭ и обеспечивает прочное связывание фермента с носителем без потери каталитической активности фермента при сохранении этой активности в процессе иммобилизации и во времени. Таким образом, путем подбора подходящих бифункциональных спейсеров на основе бороновых кислот можно осуществлять иммобилизацию ферментов-гликопротеинов, в частности, ацетилхолинэстеразы, в условиях образования прочного комплекса фермента со спейсером и максимального проявления и сохранения ферментативной активности. Преимущество предлагаемого метода заключается в том, что данный метод является 20553 мягким по условиям проведения, сравнимым с сорбционным,что позволяет максимально сохранять и стабилизировать исходную ферментативную активность в процессе иммобилизации,при хранении и дальнейшем использовании, что существенно увеличивает срок их действия, время полуинактивации достигает почти 2-х месяцев. В то же время достигаемая этим методом прочность связи фермента с носителем сравнима с таковой при химических методах иммобилизации. Новые технические приемы заявленного способа позволяют получить эффект существенного повышения активности и стабильности иммобилизованных форм ферментов за счет образования прочного боронат-диольного комплекса между карбогидратной частью фермента, не входящей в его активный центр, и дигидроксиборильными группами спейсера в условиях проявления максимальной ферментативной активности. Пример 1. Модифицирование карбоксилированных носителей бороновыми кислотами осуществляли в две стадии 1. Карбоксилированный силохром помещали в круглодонную колбу, соединенную с обратным холодильником, приливали 5-ный раствор свежеперегнанного хлористого тионила (паров 78,8 С) в свежеперегнанном толуоле (паров 107) из расчета 15 мл раствора на 1 г силохрома. Реакционную смесь нагревали на водяной бане и кипятили в течение 1 часа. Избыток хлористого тионила отмывали толуолом, после чего толуол отгоняли под вакуумом. В колбе оставался хлорангидрид силохрома. 2. 3-2-ФБ, взятую с 10-ным избытком по отношению к количеству силохрома, растворяли в предварительно высушенном над СаС 12 и К 2 СО 3 и дважды перегнанном над К 2 СО 3 непосредственно перед использованием ацетоне. Прибавляли пири дин (0,5 мл на 1 г силохрома). Полученную смесь быстро приливали к хлорангидриду силохрома. Наблюдали выделение пузырьков газа и покраснение универсального индикатора. Раствор сливали,отмывали силохром от непрореагировавшей кислоты ацетоном, водой и высушивали на воздухе. Ацетон отгоняли под вакуумом. При этом оставался небольшой осадок гидрохлорида пиридина с температурой плавления 110 - 112 С. Пример 2. К 300 мг модифицированного бороновой кислотой силохрома приливали 15 мл раствора АХЭ(концентрация 0,10-0,12 мг/л) в 0.1 М -фосфатном буферном растворе, рН которого выбирали на основе изучения взаимодействия бороновых кислот,используемых в качестве спейсеров, с диолами(Бектенова Г.А. Взаимодействие спейсеров на основе бороновых кислот с диолами. Хим. журн. Казахстана. - 2007,16. - с. 173-176.) В реакционную смесь для повышения устойчивости комплекса и уменьшения сорбции добавлялив концентрации 1 моль/л. Реакционную смесь перемешивали на качалке при температуре (04)С в течение 7 часов и оставляли на ночь в холодильнике. Избыток фермента отмывали 0,1 М-фосфатным буфером с тем же рН. Для контроля параллельно в тех же условиях проводили сорбционную иммобилизацию фермента на исходном силохроме (не модифицированном бороновой кислотой). Условия и результаты иммобилизации АХЭ в зависимости от используемого спейсера представлены в таблице. В качестве спейсеров применяли 3-Н 2-ФБК, 3-СООН-ФБК, 3-СООН-5 О 2-ФБК, 2-2-4-СООН-ФБК. Количество иммобилизованного фермента определяли флуоресцентным методом по разности концентраций фермента в растворе до и после иммобилизации. Таблица Условия проведения иммобилизации и характеристики иммобилизованных форм фермента Характеристика иммобилизованной формы ХЭ содержание Относифермента тельная на активность,носителе, мг/г Содержание фермента в полученных образцах,определенное флюоресцентным методом, составляет в зависимости от используемого спейсера от 2,75 до 3,65 мг/г. Пример 3. Активность фермента определяли амперометрическим методом, согласно которому при постоянном потенциале поляризации рабочего электрода регистрируется сила тока, протекающего в цепи. Величина этой силы тока пропорциональна концентрации деполяризатора, которым является один из продуктов реакции, в частности,ацетилтиохолин. С помощью перистальтического насоса со скоростью 6 мл/мин через систему прокачивали фоновый электролит (0,1 М КС 1). Проба, содержащая продукт реакции и введенная с помощью микрошприца в инжектор, потоком подавалась в электрохимический детектор. Изменение силы тока,вызываемое происходящей химической реакцией, регистрировалась полярографом, и результаты подавались на самописец. Электрохимический детектор представляет собой трехэлектродную ячейку с платиновой проволокой в качестве рабочего и вспомогательного электродов и хлорсеребряным электродом для сравнения. Ферментативную реакцию проводили в химическом стаканчике при постоянном перемешивании на качалке при комнатной температуре в 0,01 М -фосфатном буферном растворе с рН 7,5. Концентрация хлористого ацетилтиохолина составляла 10-2 М. Через 30 минут отбирали микрошприцем 30 мкл раствора и вводили в инжектор. Ферментативная реакция в данном случае описывается уравнением (3)3(2)23 Н 2 О(3)3(2)2 СН 3 СООН Образующийся тиохолинхлорид способен окисляться на платиновом электроде 2(3)3(2)22-(3)3(2)2 - (2)2(3). Активность АХЭ пропорциональна проис- испытании новых физиологически активных ходящему при окислении тиохолинхлорида соединений (биоскрининга) и др. областей изменению силы тока. Относительную активность биотехнологии. Предлагаемый способ позволяет иммобилизованной формы фермента рассчитывали получить иммобилизованные ферменты,как отношение активности иммобилизованной обладающие высокой активностью и формы фермента к активности, проявляемой ее стабильностью, как при хранении, так и в условиях растворимой формой, умноженное на 100. непрерывной эксплуатации. Максимальная относительная активность АХЭ(49) наблюдалась при использовании буфера с рН ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 7,9, соответствующим рН-оптимуму действия АХЭ. Наиболее подходящим спейсером является 3-Н 2 Способ иммобилизации ацетилхолинэстеразы,ФБК (рКа 9,15), образующая прочный комплекс с заключающийся в проведении взаимодействия с ферментом в щелочной области рН. предварительно модифицированным при помощи Таким образом, на основе доступного сырья спейсера носителем, в буферном растворе,разработан новый способ иммобилизации отличающийся тем, что в качестве спейсера ацетилхолинэстеразы,который может быть используют 3-аминофенилбороновую кислоту и использован при создании биосенсорных систем для процесс проводят при пониженной температуре (- 4) медицины, клинической диагностики, биохимии при (4)