Способ идентификации бруцелл методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/531 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)(57) Изобретение относится к микробиологии и молекулярной диагностике, и может быть использовано в лабораторной диагностике бруцеллезной инфекции. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение ДНК , синтез праймеров и постановку ПЦР с использованием синтезированных специфических праймеров,проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Способ позволяет обнаруживать ДНКс довольно высокой степенью точности в короткие сроки, что позволяет диагностировать данную инфекцию за 3 часа, без предварительного накопления тестируемого материала и может быть использован для экспресс-идентификации.(72) Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Богданова Марина Ивановна Матвеева Валентина Михайловна Строчков Виталий Михайлович Сансызбай Абылай Рысбайулы Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан Изобретение относится к микробиологии и молекулярной диагностике, и может быть использовано в лабораторной диагностике бруцеллезной инфекции. Способ предусматривает проведение полимеразной цепной реакции с праймерами к гену 31 рода , анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление ДНК штаммовпо результатам анализа. Способ позволяет осуществлять экспрессидентификацию . Изобретение может быть использовано для обнаружения,основанного на детекции генетического материала возбудителя и предназначено для массовых анализов. Бруцеллез до настоящего времени является одним из наиболее распространенных зоонозных инфекционных заболеваний, особенно в регионах с интенсивно развитым животноводством. Успех борьбы с бруцеллезом зависит от скорости выявления всех инфицированных животных. При диагностике бруцеллеза в ветеринарной практике используют такие методы,как бактериологический,серологический,реже аллергический. Однако ни один из них самостоятельно при однократном исследовании не позволяет выявлять всех больных (Триленко П.А.,1976 Сочнев В.В., 1984 Косилов И.А. и др., 1999., 1997 Григорьева Г.И. и др., 1998 Ощепков В.Г. и др, 2004). Эффективность бактериологического метода зависит от качества питательных сред,концентрации возбудителя в исследуемом материале, степени загрязненности последнего посторонней микрофлорой и времени, прошедшего с момента заражения животного. Срок бактериологического исследования составляет 15-30 дней, а при постановке биологической пробы он увеличивается вдвое (Журнакова М. А., 1959 Штритер В. А. и др, 1937). Диагностическая ценность серологических методов снижается из-за перекрестных реакций междуи,серовариант 09, ,и другими бактериями. Положительные результаты отмечают при серологическом исследовании здоровых животных, вакцинированных против бруцеллеза( , - ,1980 Желудков .,1982 Гайдар Б., Желудков М.М., Чернышева М.И.,1994.,,., 2000). Дифференциальная диагностика бруцеллеза возможна при исследовании сыворотки крови животных в реакции иммунодиффузии в геле агара с 0-ПС антигеном ИЭВС и ДВ. Однако по чувствительности этот метод уступает комплексу классических серологических реакций (Антонов Б. И. и др., 1994). Уровень техники Известны исследования по выявлению бруцелл ПЦР (Ю. К. Кулаков, В.Н. Горелов, В.Л. Мотин и др. Молекулярная генетика, микробиология,вирусология. 7-8, 1992, с.23-27). Клетки бактерий В. дистиллированной воде и кипятили 15 мин, затем осаждали 5 мин при 14 тыс. об/мин. В реакции амплификации использовали надосадочную жидкость. Чувствительность метода составила 104103 мкм/мл. Описан метод диагностики бруцеллеза с применением ПЦР, разработанный, ,. ,(//.2008. 69216-227). данной работе показано применение диагностического теста для обнаружения бруцелл на основе ПЦР. Были подобраны праймеры на фрагмент 43 кДа гена внешнего белка мембраны, из штамма 19. Пара праймерови 1 дает ПЦР-продукт размером 635 п.н. Амплифицированная ДНК легко обнаруживается с помощью электрофореза в агарозном геле. Оптимальная специфическая амплификация проведена при температуре отжига праймеров 60 С. Фрагмент гена был амплифицирован в 25 различных видах . Для проверки специфичности реакции были протестированы пробы ДНК, которые были выделены из 17 бактерий, взятых от крупного рогатого скота, которые показали отрицательные результаты. Чувствительность реакции определяли при различных концентрациях геномной ДНК из штамма 19. Предел обнаружения составил 0,1 мкг ДНК (менее 100 бруцелл в пробе). Специфичность и чувствительность ПЦР в сочетании с простотой и скоростью свидетельствует о возможности применения этого метода для рутинной диагностики бруцеллеза. Известен способ лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции у людей (Патент Россия 2001121392/14,опублик. 10.05.2003). Способ обеспечивает повышение чувствительности и достоверности лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции у людей с применением селективного концентрирования проб на магноиммуносорбентах,и последующим генотестированием их методом ПЦР. Использование в анализе бруцеллезных магноиммуносорбентов приводит к увеличению специфичности и чувствительности определения. Признаками,отличающими предлагаемое изобретение от перечисленных аналогов, являются специфические компоненты реакции, методические подходы и нуклеотидные последовательности праймеров,приведенные в перечне последовательностей. Технической задачей изобретения является создание способа экспресс-идентификации возбудителя бруцеллеза на основе ПЦР. Способ диагностики бруцеллеза высокочувствительный и специфичный, позволяет точно и быстро (до 3 часов) выявлять ДНК бруцелл. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение ДНК бруцелл, синтез праймеров,постановку ПЦР,проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Поставленная задача решается путем подбора пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных для рода . Для идентификации бруцеллеза методом ПЦР в качестве мишени нами была выбрана нуклеотидная последовательность гена внешней мембраны бруцелл, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа. Сравнительный анализ данного гена показал, что он имеет 100 идентичность для разных видов рода . Сущность изобретения заключается в том, что разработан способ идентификации возбудителя бруцеллеза с помощью ПЦР на участок гена 31 внешней мембраны бруцелл. ДНКвыявляется,если после разделения части реакционной смеси в агарозном геле, в анализируемом образце выявляются фрагменты ДНК размером 345 нуклеотидных пар для праймеров, специфичных гену 31 рода. Праймеры подбирали и анализировали с использованием программы - на сайте////-. Характеристики праймеров устанавливали с использованием программы . Отсутствие гомологии с ДНК других возбудителей являлось основным критерием отбора олигонуклеотидов. Подобранные пары праймеров для гена 31 отличалась высокой генетической консервативностью и присутствовали только у родаи, в то же время, отсутствовали в ДНК других возбудителей. Рассчитанные олигонуклеотиды были синтезированы на автоматическом синтезаторе 8909 ((США по стандартной методике. Синтез праймера проводили поэтапным достраиванием нуклеотида,согласно его нуклеотидной последовательности. Предложенный способ включает в себя одностадийную реакцию ПЦР с праймерами,специфичными к участку гена 31 внешней мембраны бруцелл. Праймеры 1 (прямой)и(обратный)-, состоят из 20 нуклеотидов. Реакционную смесь анализируют с помощью электрофореза в 1 агарозном геле. Присутствие в анализируемом образце фрагментов ДНК размером 345 нуклеотидных пар свидетельствует о наличии в исходном материале ДНК . Предложенный способ диагностики бруцеллеза методом ПЦР является высокочувствительным и специфичным и позволяет достоверно определять наличие ДНК родав биологических пробах без предварительного накопления тестируемого материала. Техническим результатом изобретения является повышение экономичности, сокращение времени проведения диагностической идентификации родас помощью ПЦР. Изобретение может быть использовано для обнаружения бруцелл,основанного на детекции генетического материала возбудителя и предназначено для массовых анализов. Способ выполняется следующим образом 1. Выбор последовательности праймеров. Данный этап работы представлял собой аналитический процесс, который включал сбор имеющихся нуклеотидных последовательностей,как полных геномов, так и отдельных геновиз различных международных баз данных. Получить подробную информацию можно из международных компьютерных банков данныхчерез сеть Интернет. Были отобраны последовательности генов наиболее консервативные для видов рода . По данным литературы, наиболее консервативным геном для родаявляется ген 31,кодирующий поверхностный белок с молекулярной массой 31 кД. Сравнительный анализ данного гена показал, что он имеет 100 идентичность для разных видов рода . Подбор праймеров проводили с помощью программы на сайте////-. Необходимо было подобрать фрагмент молекулы ДНК родатаким образом, чтобы два его концевых участка, находящиеся на расстоянии 200600 нуклеотидов друг от друга, отличались бы по своей структуре генетической консервативностью и присутствовали только у родаи, в то же время, отсутствовали в ДНК других возбудителей. При подборе праймеров учитывали все возможные критерии,влияющие на дальнейшую амплификацию, а именно- составоснований не более 60 и не менее 40- высокая специфичность на 3-конце праймера- разница не более 3-5 С между температурами плавления праймеров- размер ПЦР продукта в пределах 200-600 п.н. Важно отметить, что не совсем удачный выбор праймера может привести к появлению неспецифического продукта амплификации из-за образования праймерного димера. Этот побочный продукт амплификации представляет собой двунитевой фрагмент, возникающий за счет отжига праймеров с их последующей достройкой полимеразой. Праймеры должны быть специфичны. Если их специфичность недостаточна, то вероятней всего в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно синтез неспецифической ДНК. При электрофорезе неспецифическая ДНК выявляется в виде тяжелых или легких дополнительных полос, иногда шмеров,выглядящих сплошным мазком в агарозном геле. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК,что приводит к значительной потере чувствительности. Полученные праймеры были проверены на специфичность с использованием программы . В результате для данного гена были отобрана одна пара праймеров, имеющая 100 гомологию со всеми видами рода(таблица 1). Пара праймеров 1 и 1 дает ПЦР-продукт размером 345 п.н. 3 Таблица 1 Основные характеристики специфических праймеров на ген 31 для постановки ПЦР на бруцеллез Прай Последовательность (5-3) меры Начало Останов ка 301 320 645 626 2. Синтез олигонуклеотидов. Компьютерно моделированные последовательности праймеров в дальнейшем синтезировали на синтезаторе олигонуклеотидов 8909 фирмы. Синтез ДНК проводили согласно протоколам,прилагаемым к прибору. Полученные олигонуклеотиды элюировали с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривали в вакуумном испарителе, . Преципитат праймеров растворяли в ТЕ буфере и переосаждали этанолом. Полученные таким образом синтезированные праймеры используются для постановки ПЦР. 3. Выделение ДНК из образцов. Выделение ДНК проводили с использованием наборав соответствии с наставлением по применению данного набора. 1) В пробирку на 1,5 см 3 добавляли 20 мкл протеиназы К и 200 мкл исследуемого образца,300 мкл лидирующего буфера , 15 сек перемешивали на вортексе. 2) Смесь инактивировали при 56 С (10 мин),добавляли 200 мкл 96 этанола и ресуспендировали на вортексе 15 сек. Содержимое наслаивали на колонку с фильтром,затем осаждали центрифугированием в течении 1 мин при 8000 об/мин. 3) Добавляют 500 мкл промывочного буфера 1, а затем осаждают центрифугированием в течении 1 мин при 8000 об/мин. 4) Добавляют 500 мкл промывочного буфера 2, а затем осаждают центрифугированием в течение 3 мин при 14000 об/мин. 5) Осадок ресуспендируют в 200 мкл АЕ-буфера. Инкубируют при комнатной температуре (15-25 С) 1 минуту. Центрифугируют при 8000 об/мин в течении 1 мин. 4. Проведение ПЦР с праймерами,специфичными к участкам гена 31. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь наобразцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в следующей последовательности. Фермент добавляют в последнюю очередь. Используется реакционная смесь следующего состава (50 мкл) 5 мкл х 10 ПЦР буфер, 0,5 мкл ГЦ, Комплементар Комплементарность ность 1 3 60.00 6.00 2.00 60.00 4.00 0.00 Смесь перемешивают и раскапывают по 48 мкл в пробирки. Затем в них вносят отдельным наконечником по 2 мкл ДНК соответствующих анализируемых или контрольных образцов ( и -). Пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом 5. Детекция продуктов амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится методом электрофореза в 1,0 растворе агарозы в ТАЕ - буфере. Электрофорез проводят в течении 30 минут при напряжении 60 (3-5 вольт/см) на аппарате- 100 . Визуализацию полосы ДНК осуществляют с помощью бромистого этидия. Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе Трансиллюминатор. Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос. Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле на уровне полосы положительного контроля. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируется. Анализ необходимо провести заново. Фиг.1 и 2 демонстрируют конечный результат предлагаемого способа диагностики. Номера 1, 1216 пробы гетерогенные (отрицательные пробы),номера 2-11 пробы гомогенные (положительные пробы). При определении специфичности ПЦР в исследованиях использовали ДНК гомогенных и гетерогенных проб. Результаты данных опытов представлены на фиг.1. 1 - деионизированная вода, 2- штамм 19 В. морской свинки на 7 сутки после заражения штаммом 544 В. , 9-ДНК из сыворотки морской свинки на 14 сутки после заражения штаммом 544 В. , 10 - ДНК из лимфатического узла морской свинки на 21 сутки после заражения штаммом 544 В. , 11 - ДНК из селезенки морской свинки на 21 сутки после заражения штаммом 544 В. , 12 - ДНК из нормальной сыворотки морской свинки, 13 - ДНК из нормального лимфатического узла морской свинки,14 эпизоотический изолят Сайгачий пастереллез,15-штамм/2011//, 16-штамм 21 Фиг.1 Электрофореграмма продуктов амплификации при определении специфичности ПЦР Для определения чувствительности реакции использовали штамм .544 в виде клеточных лизатов с концентрацией микробных клеток от 3 до 100000 м-к/см 3. Результаты данных опытов представлены на фиг.2. М - маркер ДНК, 1-100000 м.к/см 3, 2-10000 м.к/см 3, 3-1000 м.к/см 3, 4-100 м.к/см 3, 5-10 м.к/см 3,6-9 м.к/см 3, 7-8 м.к/см 3, 8-6 м.к/см 3, 9-5 м.к/см 3, 10-4 м.к/см 3, 11-3 м.к/см 3, 12-отрицательный контроль. Фиг.2 Электрофореграмма продуктов амплификации при определении чувствительности ПЦР Предложенный способ диагностики бруцеллеза методом ПЦР специфичен и высокочувствителен. Специфический ПЦР - продукт нарабатывается только в присутствии ДНК бруцелл, предел обнаружения составил 9 микробных клеток бруцелл в пробе. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ идентификации бруцелл методом полимеразной цепной реакции, предусматривающий проведение реакции амплификации на общеродовой ген 31 внешней мембраны бруцелл, анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление ДНК разных видов родапо результатам анализа, отличающийся тем,что в качестве праймеров для проведения реакции амплификации в ПЦР,используют олигонуклеотиды из 20 звеньев,1 (прямой)и 1 (обратный), комплементарные не менее чем на 100 гену 31 внешней мембраны бруцелл, при этом присутствие в анализируемых образцах продуктов ПЦР(фрагментов ДНК) размером 345 нуклеотидных пар специфичных к гену 31, свидетельствует о наличии в исходном материале ДНК бруцелл.