Способ определения продолжительности пребывания в организме вакцинных штаммов бруцелл в полимеразной цепной реакции

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 35/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии, проведение амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР). Метод ПЦР стал одним из основных методов в экспериментальных исследованиях, позволяющий решать самые разнообразные задачи в научных исследованиях в вопросах инфекционной патологии. Технический результат, Полимеразная цепная реакция, является высокочувствительным способом индикации бруцелл,которая позволяет обнаруживать вакцинные штаммы бруцелл в самые отдаленные сроки после иммунизации животных. Данный способ индикации бруцелл рекомендуем использовать в практической лабораторной практике для диагностики бруцеллеза животных. Метод полимеразной цепной реакции позволяет обнаруживать и идентифицировать ДНК бруцелл штаммов 19, 82, 82-ПЧ в самые отдаленные сроки после иммунизации животных, при подборе праймеров и оптимальных режимных условиях 30 циклов, денатурация при 94 С, отжиг - 62 С и элонгация - 72.(72) Кушалиев Кайсар Жалитович Султанов Марсель Габдинагимович Какишев Мурат Галиханович Сидихов Бекжасар Мустакапович Саденов Марат Мурзабекович(73) Республиканское Государственное казенное предприятие Западно-Казахстанский аграрнотехнический университет им. Жангир хана Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Муллакаев О.Т. Сравнительная иммуноморфологическая ультраструктурная, иммуногенетическая оценка эффективности и реактогенности противобруцеллезных вакцин // Автореф. дисс. докт. вет. наук. Казань, 1999, с.6(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ПРЕБЫВАНИЯ В ОРГАНИЗМЕ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Изобретение относится к области молекулярной биологии, проведение амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР стал одним из основных методов в экспериментальных исследованиях,позволяющий решать самые разнообразные задачи в научных исследованиях,вопросах инфекционной патологии. Основным этапом оздоровления животных от инфекционных болезней, в том числе и от бруцеллеза,является своевременная и быстрая диагностика, где важное место занимают лабораторные исследования с целью обнаружения возбудителей в патологическом материале. Геном клетки возбудителя, его РНК и ДНК, является консервативным в отношении изменчивости, это свойство генома послужило началом по выявлению последних в патологическом материале. Существующие способы требуют много времени и не всегда дают достоверные результаты, поскольку антигенная структура возбудителей значительно изменяется из-за воздействия на них как внешних, так и внутренних факторов. Для бруцелл характерно длительное персистирование в инфицированном организме и переход их в Л - форму, определяют необходимость применения высокочувствительных и специфических методов диагностики, позволяющих выявить бактерий или их компоненты. Известен способ ДНК-ДНК гибридизации для индикации бруцелл в организме лабораторных животных,привитых противобруцеллезными вакцинами.(Муллакаев О.Т. Сравнительная иммуноморфологическая ультраструктурная,иммуногенетическая оценка эффективности и реактогенности противобруцеллезных вакцин // Автореф. дисс. докт. вет наук. - Казань, 1999, - с.6). Недостатком известного способа ДНК-ДНК гибридизации не позволяет обнаруживать ДНК вакцинных штаммов бруцелл в исследованных органах в самые отдаленные сроки после иммунизации. Задачей изобретения является разработка способа определения продолжительности пребывания в органах и тканях привитых животных антигена вакцинных штаммов бруцелл. Это дает возможность судить об уровне интенсивности и продолжительности индуктивной фазы противобруцеллезного иммунитета,разработать адекватные средства и методы иммунопрофилактики и иммунокоррекции. Технический результат, метод полимеразной цепной реакции позволяет обнаруживать и идентифицировать ДНК бруцелл штаммов 19, 82, 82-ПЧ в самые отдаленные сроки после иммунизации животных, при подборе, конструирование праймеров и при оптимизации режимных условий 30 циклов,денатурация при 94 С, отжиг - 62 С и элонгация - 72. Изобретение осуществляется следующим образом,на основе знаний генетического кода генома возбудителей инфекционных болезней, разработан метод полимеразной цепной реакции. Данный метод нами был использован для обнаружения геномов различных штаммов 19, 82, 82-ПЧ бруцелл в организме привитых морских свинок. Подготовка проб из иммунокомпетентных органов проводится следующим образом, берутся небольшие(33 мм) кусочки паренхиматозных органов морских свинок, растирают в стерильных фарфоровых чашках и суспендируют в буфере ТЕ (1 мМ трис- рН 7,8 0,01 мМ ЭДТА). Затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут, надосадок выливают в дезинфицирующий раствор, а осадок ресуспендируют в ТЕ буфере в количестве 1/10 части первоначального объема. Подготовленную бактериальную массу инкубируют 5 минут в кипящей водяной бане и еще раз центрифугируют при 8000 об/мин, в течение 15 минут. Надосадочную жидкость в количестве 3 мкл используют в полимеразной цепной реакции. Важным компонентом ПЦР являются синтетические, комплементарные к специфичному локусу генома бруцелл олигонуклеотиды (праймеры). По основе расшифрованной нуклеотидной последовательности (секвенса) ДНК штамма 19 нами были сконструированы пары праймеров В 1 и В 2. ПЦР проводится на автоматическом термоциклере,который позволяет поддерживать заданный температурный и временный режим амплификации. Результаты амплификации визуализируют при помощи электрофореза в 1,7-ном агарозном геле. Фрагменты ДНК окрашивают бромистым этидием. Применив метод ДНК-ДНК гибридизации для индикации бруцелл в организме морских свинок,привитых противобруцеллезными вакцинами из штаммов 19, 82 и 82-ПЧ, на 120-е сутки опыта во всех исследованных лимфоидных органах не выявляли ДНК бруцелл, а с помощью метода ПЦР обнаруживают ДНК бруцелл штаммов 19, 82, 82-ПЧ через 120 дней. Таким образом, полимеразная цепная реакция,является высокочувствительным способом индикации бруцелл, которая позволяет обнаруживать вакцинные штаммы бруцелл в самые отдаленные сроки после иммунизации животных. Данный способ индикации бруцелл рекомендуем использовать в практической лабораторной практике для диагностики бруцеллеза животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения продолжительности пребывания в организме вакцинных штаммов бруцелл в полимеразной цепной реакции,включающий обнаружение и идентифицикацию ДНК бруцелл штаммов 19, 82, 82-ПЧ в самые отдаленные сроки после иммунизации животных,отличающийся тем, что проводят подбор,конструирование праймеров и оптимизацию режимных условий по следующим параметрам амплификация - 30 циклов, денатурация - 94 С,отжиг - 62 С и элонгация - 72.