Способ диагностики оспы верблюдов (camel pox virus) на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР)

(51) 01 33/53 (2010.01) 01 33/569 (2010.01) 12 15/10 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)(57) Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных, а именно вируса оспы верблюдов. Способ выявления вируса оспы верблюдов осуществляется путем выделения вирусной ДНК и постановки полимеразной цепной реакции, при которой с использованием специфических праймеров с последующим выявлением ДНК вируса оспы верблюдов. Способ позволяет обнаруживать ДНК вируса оспы верблюдов с довольно высокой степенью точности в короткие сроки и диагностировать данную инфекцию за 1,5 часа. Разработанная ПЦР тест-система является специфичным и высокочувствительным при диагностике оспы верблюдов.(72) Ажибаева Дана Тынышбековна Строчков Виталий Михайлович Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Червякова Ольга Викторовна Зайцев Валентин Лукьянович Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Сансызбай Абылай Рысбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСПЫ ВЕРБЛЮДОВ НА Изобретение относится к области вирусологии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных, а именно вируса оспы верблюдов. В последнее время в дальнем и ближнем зарубежье применяются высокочувствительные и специфические методы диагностики последовательностей нуклеиновых кислот для выявления ДНК ортопоксвирусов. Известен способ дуплекс полимеразной цепной реакции для диагностики оспы верблюдов. ПЦР продукт, образующийся в результате амплификации,составляет 243 и 96 п.о. (пар оснований). Амплификацию проводят при следующем температурно-временном режиме 95 С - 3 мин 94 С 30 сек 60 С - 45 сек 72 С - 45 сек, повторяя цикл 34 раз. Чувствительность разработанной ПЦР был низок 0,4 нг вирусной ДНК. Разработанный метод успешно применяется для прямого обнаружения и дифференциации оспы верблюдов от других ортопоксвирусов,каприпоксвирусов и парапоксвирусов, как в клеточных культурах, так и клинических образцах. (. , .. 21231-237 (2009). Известен способ идентификации и дифференциации оспы верблюдов и вирус вакцины методом ПЦР. Разработанный метод ПЦР для идентификации и дифференциации оспы верблюдов и вирус вакцины включает два метода выделения ДНК из инфицированных клеточных культур и хориоалантоисной мембраны. Амплификацию проводят при следующем температурновременном режиме 99 С - 15 мин 94 С - 1 мин 40 С - 1 мин 72 С - 2,5 мин., повторяя цикл 35 раз. (Н.М.А, , А.Н. .. //. 200941(8) 1637-41.200930). Недостатками данных способов является длительный временной режим,значительно увеличивают время проведения исследований. Целью настоящего изобретения являлось разработка тест-системы для идентификации вируса оспы верблюдов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа диагностики оспы верблюдов методом ПЦР, применяемая для выявления ДНК вируса оспы верблюдов из клинического материала в ветеринарной практике. Сущность изобретения заключается в разработке высокочувствительной и эффективной тест-системы для диагностики оспы верблюдов на основе полимеразной цепной реакции. Диагностика вируса оспы верблюдов высокочувствительным и специфичным методом полимеразной цепной реакцией позволяет точно и очень быстро (1,5 часа) выявлять ДНК вируса оспы верблюдов с разных клинических проб. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Практический результат изобретения заключается в выделении ДНК вируса оспы верблюдов и проведении анализа на наличие вируса в пробах от больных и павших животных. Выделение ДНК вируса оспы верблюдов Пример 1. Выделение ДНК вируса оспы верблюдов из инфицированной культуры клеток и патологических биоматериалов от больных верблюдов. В пробу очищенного вируссодержащего материала добавляют лизирующий буфер(гуанидинизотиоционат, 0,1 М трис-,6,4, 0,2 М ЭДТА,8,0, тритон Х-100) и готовый сорбент О 2 перемешивают на вортоксе. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин. После инкубирования осаждают центрифугированием в течение 1 мин при максимальной скорости. Дважды промывают промывочным буфером и осаждают центрифугированием в течение 1 мин при максимальной скорости. Осадок дважды промывают 70 спиртом, (осадок не ресуспендировать), центрифугируют 1 мин при максимальной скорости. Удаляют супернатант, осадок высушивают в пробирках с открытыми крышками при 56 С в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют ТЕ-буфером инкубируют при 56 С в течение 10 мин. Центрифугируют при максимальной скорости в течение 2 мин. Супернатант переносят в новую пробирку и еще раз центрифугируют для удаления оставшихся силикачастиц при максимальной скорости в течение 1 мин. Затем снова переносят в новую пробирку и используют для постановки ПЦР-анализа. Образцы исследуемого биологического материала мелко нарезают с помощью скальпеля и помещают в ступки с песком. Материал растирают до образования однородной массы, и добавляют физиологический раствор для получения 20-ной суспензии(вес/объм). Далее выделение вирусной ДНК проводят по методике с использованием сорбента О 2. Проведение ПЦР В работе используют специфические праймеры-Для проведения ПЦР готовят реакционную смесь следующего составаобщий объем 50 мкл х 10 ПЦР буфер- 1 мкл ДНК вируса ОВ- 0,4 мкл Деионизированная стерильная вода - 39,6 мкл Реакцию проводят в термоциклере 9700, фирмы. При проведении ПЦР используют температурновременной режим 5 мин 94 С 20 с 94 С (денатурация) 20 с 55 С (отжиг) 35 циклов 20 с 72 С (синтез) 10 мин 72 С Анализ результатов По завершению наработки ДНК, полученные пробы детектировали электрофорезом в 1 агарозном геле, приготовленном на ТВЕ буфере в присутствии бромистого этидия. Определение чувствительности метода При определении чувствительности разработанного метода ПЦР использовали 10-кратные разведения ДНК вируса оспы верблюдов (штамм М 96), в концентрации от 10 нг до 1 фг. Чувствительность метода ПЦР составила 100 пг ДНК вируса оспы верблюдов. Результаты данного эксперимента представлены на фиг.1. Данные результаты показывают, что отработанный метод ПЦР обладает высокой чувствительностью. Определение специфичности метода Для определения специфичности ПЦР набора использовали культуральные жидкости, содержащие вирус оспы верблюдов. В опытах в качестве матрицы нуклеиновых кислот использовали нуклеиновые кислоты гетерологичных поксвирусов, а именно оспы овец, оспы коз, оспы коров, оспы кур, оспа лошадей,оспавакцины, контагиозной эктимы овец и коз, а также эктромелии мышей. В качестве положительного образца использовали ДНК вируса оспы верблюдов штамма М-96. Как показывают экспериментальные данные только в пробах, содержащих ДНК вируса оспы верблюдов нарабатываются специфические продукты реакции размером около 266 п.о. Отрицательные результаты были получены при использовании в качестве матриц ДНК вирусов оспы овец, оспы коз,оспа коров, оспа кур, а также оспавакцина, оспа лошадей, вирус контагиозной эктимы овец и коз,вирус эктромелии мышей. Полученные результаты демонстрируют специфичность разработанного нами метода. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики вируса оспы верблюдов семействародаметодом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем,что для выявления ДНК используют специфические праймеры