Способ диагностики гемагглютинина Н3 вируса гриппа лошадей методом полимеразной цепной реакции

(51) 61 39/145 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области ветеринарии,точнее - к ветеринарной вирусологии и молекулярной диагностике, и касается способа диагностики гриппа лошадей. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение вирусной РНК, синтез к ДНК, синтез праймеров и постановку ПЦР с использованием синтезированных специфических праймеров, проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Способ позволяет осуществлять экспрессидентификацию ВГЛ субтипа НЗ. Изобретение может быть использовано для обнаружения ВГЛ субтипа НЗ, основанного на детекции генетического материала возбудителя, и предназначено для массовых анализов с возможной автоматизацией процесса. Способ позволяет обнаруживать РНК вируса гриппа лошадей с довольно высокой степенью точности в короткие сроки, что позволяет диагностировать данную инфекцию за 6 часов.(72) Строчков Виталий Михайлович Матвеева Валентина Михайловна Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Сейсенбаева Мадина Сагадатовна Корягина Марина Ивановна Сансызбай Абылай Рысбайулы Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Нурабаев Сергазы Шуратбаевич Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕМАГГЛЮТИНИНА Н 3 ВИРУСА ГРИППА ЛОШАДЕЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Область применения. Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и может быть использовано для обнаружения вируса гриппа лошадей (ВГЛ) субтипа НЗ, основанного на детекции генетического материала возбудителя и предназначено для массовых анализов с возможной автоматизацией процесса. Уровень техники. Известен способ обнаружения вируса гриппа А подтипа 51 с помощью ОТ-ПЦР с РНК штаммов вирусов гриппа А (Патент Россия 2007143086/13, опублик. 20.07.2009). Способ позволяет осуществлять одностадийную экспрессидентификацию вируса гриппа А подтипа 51. Изобретение может быть использовано для обнаружения вируса гриппа типа А подтипа 51,основанного на детекции генетического материала возбудителя. Известен метод диагностики гриппа лошадей, с применением полимеразной цепной реакции,разработанныйС. , ., . (//639-43. 1994). Метод предназначен для выявления гриппа в выделениях из носа, вакцинах и аллантоисной жидкости. Метод коррелировал с результатами выделения вируса в культуре клеток и позволял обнаруживать ВГЛ в период от 3 до 6 суток после инфицирования. Вышеуказанные аналоги представляющие тестсистему ПЦР для определения РНК ВГЛ,описывают способ диагностики, отличающийся от предлагаемого изобретения специфическими компонентами и методическими подходами. Сущность изобретения заключается в том, что разработан способ выявления вируса на основе амплификации участка кДНК ВГЛ с помощью совмещенной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) участка вирусного гена гемагглютинина для увеличения количества копий ДНК ВГЛ субтипа НЗ. При этом уровень гомологии подобранных праймеров составляет не менее 95 для этого гена. Вирус выявляется,если после разделения части реакционной смеси в агарозном геле, в анализируемом образце выявляются фрагменты ДНК размером 207 нуклеотидных пар для праймеров, специфичных гену НЗ. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение вирусной РНК, синтез кДНК, синтез праймеров, постановку ПЦР,проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Задача изобретения. Разработка способа экспресс-идентификации ВГЛ субтипа НЗ, на основе ОТ-ПЦР. Способ диагностики ВГЛ является высокочувствительным и специфичным методом ОТ-ПЦР позволяет точно и быстро (до 6 часов) выявлять РНК ВГЛ данного субтипа в биологических пробах без предварительного накопления тестируемого вируса, что особенно важно при работе с высокопатогенными штаммами. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. 2 Поставленная задача решается путем подбора пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных для ВГЛ субтипа НЗ. Праймеры подбирали и анализировали с использованием программы 3, а также приложения. Характеристики праймеров устанавливали с помощью программы. Отсутствие гомологии с другими вирусами семействаи с другими подтипами вируса гриппа А являлось основным критерием отбора олигонуклеотидов. Для гена НА ВГЛ подтипа НЗ была подобрана пара праймеров, которая являлась высоко консервативной и специфичной к своему подтипу и не имела гомологии с другими подтипами вируса гриппа А и с другими родственными вирусами. Рассчитанные олигонуклеотиды были синтезированы на автоматическом синтезаторе 349/((США) по стандартной методике. Синтез праймера проводили поэтапным достраиванием нуклеотида, согласно его нуклеотидной последовательности. Предложенный способ включает в себя реакцию ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к участку гена гемагглютинина НЗ ВГЛ. Матрицей для этой реакции служит кДНК вируса гриппа, а затравкой праймеры -3, состоящий из 22 звеньев. Реакционную смесь анализируют с помощью электрофореза в 2 агарозном геле. Присутствие в анализируемом образце фрагментов ДНК размером 207 нуклеотидных пар свидетельствует о наличии в исходном материале РНК ВГЛ субтипа НЗ. Техническим результатом изобретения является разработка способа экспресс-идентификации ВГЛ подтипа НЗ с помощью ОТ-ПЦР. Изобретение может быть использовано для обнаружения ВГЛ субтипа НЗ, основанного на детекции генетического материала возбудителя и предназначено для массовых анализов с возможной автоматизацией процесса. Способ выполняется следующим образом 1 .Выделение РНК из образцов Выделение РНК проводят с использованием наборав соответствии с наставлением по применению данного набора. 2. Синтез кДНК Реакцию обратной транскрипции проводят в объеме 20 мкл. Реакционная смесь содержит 10 пМ праймер , 4 ед., 10 еди 5 мкл раствора суммарной РНК. Для синтеза кДНК проводят инкубацию при 42 С в течение 90 минут. После этого смесь прогревают при 85 С течение 5 минут. По истечении времени пробы синтезированной кДНК используют непосредственно в реакции ПЦР или помещают в холодильник на минус 20 С до использования. 3. Проведение ОТ-ПЦР со специфичными праймерами к участкам гена НЗ. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на -ное количество образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в следующей последовательности. Ферменты добавляют в последнюю очередь. ПраймерПраймерполимераза Режим Начальная денатурация Денатурация Отжиг Элонгация Завершающая элонгация Н 2 О 12,5 мкл кДНК 5 мкл Общий объем реакционной смеси 25 мкл Смесь перемешивают и раскапывают по 20 мкл в пробирки, в каждую пробирку добавляют по 2-3 капли масла (примерно 40 мкл). Затем в них вносят отдельным наконечником с фильтром под масло по 5 мкл РНК соответствующих анализируемых или контрольных образцов (К и К). Пробы вносят в амплификатор режимом Температура 94 С 94 С 57 С 72 С 72 С 4. Детекция продуктов амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится методом электрофореза в 2,0 растворе агарозы в трис-боратном буфере(ТБЕ). Электрофорез проводят в течение 2 час при напряжении 60 (3-5 вольт/см) на аппарате -100 . Визуализацию полосы ДНК осуществляют с помощью бромистого этидия. Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе Трансиллюминатор. Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос. Положительными считают пробы, полосы которых располагаются в геле на уровне полосы положительного контроля. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново. Предложенный способ диагностики ВГЛ методом ОТ-ПЦР является высокочувствительным и специфичным к субтипу НЗ и позволяет достоверно определять наличие РНК ВГЛ данного субтипа в биологических пробах без предварительного накопления тестируемого вируса, что особенно важно при работе с высокопатогенными штаммами и может быть использован для экспрессидентификации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики гемагглютинина Н 3 вируса гриппа лошадей методом полимеразной цепной реакции, включающий применение тестсистемы для выявления РНК субтипа Н 3 вируса гриппа лошадей, отличающийся тем, что при разработке полимеразной цепной реакции используют в качестве праймеров, которые выявляют в анализируемых образцах фрагменты нуклеиновых кислот размером 207 нуклеотидных пар.