Способ получения in vitro микроклубнелуковиц крокуса алатауского

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ свежую питательную среду в условиях световой комнаты до образования микроклубнелуковиц,согласно полезной модели, предварительно цельные клубнелуковицы выдерживают в мыльном растворе 30-40 минут с последующей промывкой водой,замачивают в растворе препарата Максим в течение 4,5 часов, затем в 70 - ном этиловом спирте в течение 3 мин и 0,15 - ном растворе сулемы в течение 13 мин, после этого растительный материал промывают стерильной дистиллированной водой и помещают в питательную среду МС с регуляторами роста, в качестве которых используют цитокинин 6 - бензиламинопурин (БАП), ауксин(НУК),хлорхолинхлорид (ССС), культивируют в течение 30 дней в условиях световой комнаты, где поддерживают 16-ти часовой фотопериод,влажность 60 и температуру 22-24 С,пассирование материала на свежую питательную среду проводят через каждый месяц культивирования в течение восьми месяцев, для активации пазушных почек используют основную среду МС с внесением 2,0 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК,продолжительность культивирования - два пассажа,общей длительностью до 8 недель, затем культивируют с использованием основной среды МС с внесением 6,0 мг/л БАП, продолжительностью до четырех пассажей и общей длительностью до 16 недель, для формирования микроклубнелуковиц и их созревания используют основную среду МС с добавлением 60 г/л сахарозы, 2 мг/л БАП и 250 мг/л ССС при длительности культивирования 6-8 недель.(72) Мурсалиева Валентина Кадаматовна Сатыбалдиева Дария Нурбатыровна Нам Светлана Валентиновна Рахимбаев Избасар Рахимбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(74) Алчимбаева Раушан Темирхановна Бавлакова Анна Вячеславовна(57) Полезная модель относится к биотехнологии, а именно к способу размножения крокуса алатауского(шафрана алатауского) и может быть использовано для воспроизведения популяции редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Достигаемый результат - упрощение способа и повышение доступности для реализации. Указанный результат достигается тем, что в способе получениямикроклубнелуковиц крокуса алатауского путем микроразмножения из сегментов клубнелуковиц, при котором сегменты клубнелуковиц размером до 1 см с почкой помещают на питательную среду Мурасиге - Скуга(МС) с добавлением регуляторов роста и культивируют при пассировании материала на Полезная модель относится к биотехнологии, а именно к способу размножения крокуса алатауского(шафрана алатауского) и может быть использовано для воспроизведения популяции редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Дикорастущий крокус алатауский С., эндемик Средней Азии является ценным декоративным растением. В результате бесконтрольной хозяйственной деятельности человека численность его природных популяций резко снизилась и с 2006 г вид занесен Постановлением Правительства РК в Перечень редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Малочисленные природные популяции,трудности введения в условия культуры, низкая всхожесть семян дикорастущих крокусов обуславливают необходимость разработки альтернативных путей их размножения и сохранения, в частности на основе метода культуры тканей. Известен способ размножения шафрана посевного (крокуса), при котором перед посадкой очищенные клубнелуковицы обрабатывают кристаллами ионола из расчета 10 мг на одну луковицу, а также погружают в растворы ионола концентрацией 0,5 или 1,0 и выдерживают их 8 часов (.с. СССР 438400, кл. А 01 Н 5/00, 1975). Указанный способ позволяет размножать растения только с помощью деток, что снижает его эффективность. Известен способ микроразмножения шафрана посевного (.) с помощью культуры ткани, включающий получение растений из сегментов клубнелуковиц, при котором сегменты клубнелуковиц 0,7-2,0 см в ширину и 1,0-2,0 см в высоту помещают на питательную среду 1,содержащую минеральные соли по Мурасиге Скугу, 1 мг/л никотиновой кислоты, 10 мг/л тиамина, 10 мг/л пиридоксина, 10 мг/л глицина,10 мг/л аденина, 10 мг/л тирозина, 100 мг/л инозина,5 мг/л фолиевой кислоты, 500 мг/л гидролизата казеина, 70 мг/л агара, 0,1-1,0 мг/л индолилуксусной кислоты, 0,1-1,0 мг/л зеатина, 3,0 г/л глюкозы,культивируют при температуре 7-10 С и освещенности 4-5 тыс. люкс до образования каллуса, переносят на свежую питательную среду того же состава и культивируют до образования клубнелуковичек, которые переносят на среду 2,содержащую половинную по концентрации норму компонентов среды 1 и дополнительно 0,1-1,0 мг/л индолилуксусной кислоты, культивируют до появления корней и побегов, помещают в раствор,стимулирующий корнеобразование, и выдерживают во влажном субстрате во влажной камере до формирования нормальных растений (Патент СССР 1807843, кл. А 01 Н 4/00, 1993). Для реализации данного способа требуется питательная среда, содержащая большое количество компонентов, что усложняет способ и ухудшает его доступность. Задачей полезной модели является разработка способа размножения крокуса алатауского (шафрана алатауского) для воспроизведения популяции редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Достигаемый результат - упрощение способа и повышение доступности для реализации. Указанный результат достигается тем, что в способе получениямикроклубнелуковиц крокуса алатауского путем микроразмножения из сегментов клубнелуковиц, при котором сегменты клубнелуковиц размером до 1 см с почкой помещают на питательную среду Мурасиге - Скуга(МС) с добавлением регуляторов роста и культивируют при пассировании материала на свежую питательную среду в условиях световой комнаты до образования микроклубнелуковиц,согласно полезной модели, предварительно цельные клубнелуковицы выдерживают в мыльном растворе 30-40 минут с последующей промывкой водой,замачивают в растворе препарата Максим в течение 4,5 часов, затем в 70-ном этиловом спирте в течение 3 мин и 0,15-ном растворе сулемы в течение 13 мин, после этого растительный материал промывают стерильной дистиллированной водой и помещают в питательную среду МС с регуляторами роста, в качестве которых используют цитокинин 6 бензиламинопурин(НУК),хлорхолинхлорид (ССС), культивируют в течение 30 дней в условиях световой комнаты, где поддерживают 16-ти часовой фотопериод,влажность 60 и температуру 22-24 С,пассирование материала на свежую питательную среду проводят через каждый месяц культивирования в течение восьми месяцев, для активации пазушных почек используют основную среду МС с внесением 2,0 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК,продолжительность культивирования - два пассажа,общей длительностью до 8 недель, затем культивируют с использованием основной среды МС с внесением 6,0 мг/л БАП, продолжительностью до четырех пассажей и общей длительностью до 16 недель, для формирования микроклубнелуковиц и их созревания используют основную среду МС с добавлением 60 г/л сахарозы, 2 мг/л БАП и 250 мг/л ССС при длительности культивирования 6-8 недель. Полезная модель поясняется изображением, где на фиг.1 показан этап активации роста пазушных почек на первичном экспланте клубнелуковицы на фиг.2 - этап собственно микроразмножения на фиг.3 - этап формирования клубнелуковицы на фиг.4- клубнелуковицы, полученные. Способ реализуют следующим образом. Для культивированияиспользуют сегменты с пазушными или апикальными почками,изолированные из молодых клубнелуковиц на этапе завершения закладки в них генеративных и вегетативных органов и до перехода в состояние вынужденного покоя (июль-август месяцы). С одной материнской клубнелуковицы можно получить в среднем до 4-5 эксплантов с покоящимися почками. Предварительно цельные клубнелуковицы выдерживают в мыльном растворе 30-40 минут с последующей промывкой под струей водопроводной воды. Дальнейшая обработка растительного материала проводится в условиях ламинар-бокса по следующей схеме замачивание в растворе препарата Максим в течение 4,5 часов в 70 - ном этиловом спирте 3 мин в 0,15 - ном растворе сулемы 13 мин. Затем растительный материал промывают стерильной дистиллированной водой и помещают в стерильную чашку Петри. После стерилизации в асептических условиях каждую клубнелуковицу делят на 4-5 сегментов размером 0,5-1 см с почкой. Средний выход жизнеспособных эксплантов через 20-25 дней культивирования составляет 30. Высаженный на питательную среду материал переносят в условия световой комнаты, где поддерживают следующие параметры 16-ти часовой фотопериод, влажность 60, температура 22-24 С. Еженедельно визуально оценивают рост и развитие эксплантов. Питательная среда состоит из основной среды по прописи Мурасиге - Скуга (МС) с включением регуляторов роста цитокинина 6 бензиламинопурина-нафтилуксусной кислоты (НУК), ретарданта роста хлорхолинхлорида (ССС). Длительность одного цикла культивирования - 30 дней. Пассирование материала на свежую питательную среду проводят через каждый месяц культивирования,за исключением этапа клубнеобразования. Процесс формирования клубнелуковицпроисходит последовательно и включает поэтапное использование разных по гормональному составу вариантов питательной среды МС. 1 этап - активация роста пазушных почек основная среда МС с внесением 2,0 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК. Продолжительность культивирования два пассажа,общей длительностью около 8 недель (0 и 1 пассажи). Прямая регенерация побегов на эксплантах клубнелуковиц происходит за счет активации роста пазушных почек, локализованных на поверхности клубнелуковиц в результате индуцирующего действия цитокинина БАП (фиг.1). 2 этап - собственно микроразмножение основная среда МС с внесением 6,0 мг/л БАП. Продолжительность культивирования - до четырех пассажей, общей длительностью до 16 недель (25 пассажи). Полученные на первом этапе пазушные побеги далее пассируют на среду с повышенным уровнем БАП. Побеги при этом удлиняются и у базальной части закладываются дополнительные почки, из которых развиваются адвентивные побеги. Отросшие новые побеги опять отделяют и пересаживают на свежую среду для дальнейшего размножения (фиг.2). Процедуру повторяют несколько раз для получения максимального количества адвентивных побегов. 3 этап - формирование микроклубнелуковиц и их созревание основная среда МС с повышенным(6 пассаж). Для стимулирования формирования клубнелуковиц у полученных на втором этапе побегов отбирают наиболее развитые и переносят на индуцирующую среду. Побеги культивируют без дальнейшего пассирования, несмотря на истощение питательной среды. В начальный период отмечается постепенное утолщение основания побега и его разрастание, а через четыре недели становятся заметными клубневидные образования с усыхающими покровными чешуями,характерными для клубнелуковиц крокуса (фиг.3). Важными факторами для созревания клубнелуковици получения полноценного посадочного материала являются повышенный уровень сахарозы и наличие хлорхолинхлорида в индуцирующей среде. Диаметр полученных клубнелуковиц составляет 1-1,3 см, средний вес от 0,4 г - 0,9 г (фиг.4). Микроклубнелуковички с хорошо сформировавшейся туникой высушивают в тени в комнатных условиях в течение недели, затем помещают на хранение вплоть до высадки в полевые условия. В основе разработанного способа лежит метод культивирования, при котором в искусственных условиях индуцируется процесс регенерации целого растения из изолированных органов и тканей. Разработанный способ применим для дикорастущих казахстанских видов крокуса с учетом их генотипических особенностей при культивировании, которые затрагивают оптимальные сроки изолирования эксплантов,гормональный состав питательной среды, сроки и продолжительность культивирования. Разработанный способ размножения осуществляется по следующей схеме введение в культуру - собственно микроразмножение клубнеобразование. Исходным материалом являются донорные растения крокуса из природных популяций или их образцы, введенные в условия интродукции. Для культивированияиспользуют сегменты молодых клубнелуковиц с пазушными или апикальными почками. Регенерация происходит путем прямого побегообразования посредством индукции роста пазушных почек. Увеличение интенсивности размножения достигается за счет закладки у основания побегов дополнительных почек в результате стимулирующего действия регуляторов роста питательной среды. Общая длительность культивирования от введения первичных эксплантов до получения клубнелуковиц составляет 6-8 месяцев, с июля по февраль месяц. Выход микроклубнелуковиц при использовании предлагаемого способа размножения составляет до 10 штук на первичный эксплант или 30-40 на исходную материнскую клубнелуковицу. 3 В природе крокус размножается вегетативно, при этом на месте материнской клубнелуковицы к концу вегетации образуется как правило одна дочерняя и не более 3-4 деток. Разработанный способ предназначен для сохранения и размноженияредкого дикорастущего крокуса, получения его первичного посадочного материала в виде клубнелуковиц,свободных от патогенной инфекции. Использование данного способа позволит восстановить эндемичный вид без существенного ущерба его природным популяциям для дальнейшего научногопрактического применения и рационального использования генетических ресурсов крокуса флоры Казахстана. ФОРМУЛА ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ Способ получениямикроклубнелуковиц крокуса алатауского путем микроразмножения из сегментов клубнелуковиц, при котором сегменты клубнелуковиц размером до 1 см с почкой помещают на питательную среду Мурасиге - Скуга(МС) с добавлением регуляторов роста и культивируют при пассировании материала на свежую питательную среду в условиях световой комнаты до образования микроклубнелуковиц,отличающийся тем, что предварительно цельные клубнелуковицы выдерживают в мыльном растворе 30-40 минут с последующей промывкой водой,замачивают в растворе препарата Максим в течение 4,5 часов, затем в 70 - ном этиловом спирте в течение 3 мин и 0,15 - ном растворе сулемы в течение 13 мин, после этого растительный материал промывают стерильной дистиллированной водой и помещают в питательную среду МС с регуляторами роста, в качестве которых используют цитокинин 6 - бензиламинопурин (БАП), ауксин(НУК),хлорхолинхлорид (ССС), культивируют в течение 30 дней в условиях световой комнаты, где поддерживают 16-ти часовой фотопериод,влажность 60 и температуру 22-24 С,пассирование материала на свежую питательную среду проводят через каждый месяц культивирования в течение восьми месяцев, для активации пазушных почек используют основную среду МС с внесением 2,0 мг/л БАП и 0,5 мг/л НУК,продолжительность культивирования - два пассажа,общей длительностью до 8 недель, затем культивируют с использованием основной среды МС с внесением 6,0 мг/л БАП, продолжительностью до четырех пассажей и общей длительностью до 16 недель, для формирования микроклубнелуковиц и их созревания используют основную среду МС с добавлением 60 г/л сахарозы, 2 мг/л БАП и 250 мг/л ССС при длительности культивирования 6-8 недель.