Способ микроклонального размножения ячменя и овса in vitro

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Скуг с содержанием фитогормонов, и формирование из них полноценных растений на 28-30 сутки. Способ состоит в том, что для получения растений в условияхв качестве экспланта используют узлы стебля овса и ячменя. В фазу выхода в трубку растения срезают и разделяют на сегменты с узлом стебля длиной 1,0- 1,5 см. Стерилизацию сегментов производят в асептических условиях 70 раствором белизны в течение 5 минут, затем промывают би-дистиллированной водой 3-4 раза. Культивирование узлов проводят на искусственной питательной среде Мурасиге и Скуг с добавлением мезоинозита - 100 мг/л, 6-БАП - 2,0 мг/л. Образовавшиеся побеги культивируют на среде для укоренения растений МС с содержанием ИУК - 2,0 мг/л. Предлагаемый способ микроклонального размножения ячменя и овса, позволяет в короткие сроки, без регулярного пассирования, а соответственно, и дополнительных затрат на химические реактивы, получить полноценные растения-регенеранты.(72) Каманова Светлана Георгиевна Москаленко Виктория Михайловна Швидченко Владимир Корнеевич Оразбаева Гульзада Кызырияновна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЯЧМЕНЯ И ОВСА(57) Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности к размножению ячменя и овса и может применяться при размножении и длительном сохранении зерновых культур с ценными генетическими признаками. Технической задачей изобретения является увеличение выхода растенийза короткие сроки, которая достигается за счет стерилизации узлов стебля и их культивирование на питательной среде Мурасиге и Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности к размножению ячменя и овса и может применяться при размножении и длительном сохранении ячменя и овса с ценными генетическими признаками. Известен способ клонального микроразмножения клевера лугового в культуре латеральных почек (И.Г. Кирьян, В.В. Мазин, А.С. Шаин, Сельскохозяйственная биология, 1990, 5,с.-94-97). Латеральные почки выделяли из растений клевера лугового. Экспланты после поверхностной стерилизации в течение 6 мин 0,1 раствором диацида помещали на питательную среду Гамборга В 5 с содержанием 6-бензиламинопурина (6- БАП). Почки культивировали при непрерывном освещении в климатической камере. Продолжительность одного пассажа составляла 4 недели. Недостатком данного метода является низкий выход растений - регенерантов, поскольку для размножения берутся растения из полевых или вегетационных опытов. Известен способ микроклонального размножения гладиолуса (см. патент РФ, 2180165,кл. 2000102093/13,10.03.2002 г). Способ предусматривает замачивание водопроводной водой в течение 24 ч клубнелуковиц с последующей поверхностной их стерилизацией 6-ным раствором гипохлорида натрия в течение 15 мин и промыванием 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в течение 1 ч, повторную стерилизацию 90 ным этанолом в течение 10 мин и трехкратное промывание, затем клубнелуковицы освобождают от туники и стерилизуют последовательно 70-ным этанолом в течение 5-7 мин и 90-ным - в течение 1 мин. После трехкратного промывания клубнелуковиц стерильной дистиллированной водой вырезают апикальные почки с прилегающими участками ткани и помещают в жидкую питательную среду Мурасиге и Скуг (МС) (с объемом среда/число эксплантов 31),дополненную 10,0-11,0 мг/л 6-БАП, затем проводят культивирование на шейкере при 100 мин с непрерывным освещением при температуре 252 в течение 28-30 дней, а после пролиферирующие почки разделяют на одиночные и кластеры из 3-4 почек и культивируют при непрерывном освещении и температуре 252 на агаризованной среде,содержащейМурасиге и Скуг. Полученные побеги подвергают укоренению на средеМС с низким содержанием азота и добавлением активированного угля при фотопериоде 16 ч день при 27- 28, 8 ч ночь при 19-21, после чего указанные побеги высаживают. Недостатком данного способа является длительный и многократный процесс стерилизации эксплантов. Известен способ размножения гречихи(см. патент АН СССР, 4485034/13, кл. 1658928 А 1, 30.06.91 г.). Приведенный способ по совокупности признаков и достигнутому положительному эффекту является наиболее близким техническим решением(прототипом). Способ состоит в том, что в качестве эксплантов используются стерильные или простерилизованные донорные растения, из которых вычленяют узлы с частью стебля и листом (1,5-2 см), а культивирование и субкультивирование их осуществляется на одной и той же модифицированной питательной среде Гамборга В 5 с 6-БАП из расчета 5-10 мг/л среды, при последующих субкультивированиях концентрация 6-БАП уменьшалась до 1-2 мг/л. Материал инкубируют в условиях 16-часового фотопериода при освещении 7000 люкс и температуре 242 в закрытых прозрачных сосудах. Культивирование проводят в течение 3-4 недель. Недостатком данного способа является то, что при уменьшении концентрации 6-БАП процесс размножения идет менее интенсивно и при больших затратах времени. Технической задачей изобретения является увеличение выхода растенийза короткие сроки, которая достигается за счет стерилизации узлов стебля и их культивирование на питательной среде Мурасиге и Скуг с содержанием фитогормонов,и формирование из них полноценных растений на 28-30 сутки. Сущность предусмотренного способа иллюстрируется следующим образом. Для получения растений в условияхв качестве экспланта используют узлы стебля сорта овса Никола и сорта ячменя Астана 2007. Донорные растения выращивают как в полевых, так и в тепличных условиях. В фазу выхода в трубку растения срезают. После чего разделяют на сегменты с узлом стебля длиной 1,0-1,5 см. стерилизацию сегментов производят в асептических условиях 70 раствором белизны в течение 5 минут, затем промывают би-дистиллированной водой 3-4 раза. Культивирование узлов проводят на искусственной питательной среде Мурасиге и Скуг с добавлением мезоинозита - 100 мг/л, 6-БАП - 2,0 мг/л (таблица 1). Таблица 1 Питательная среда Мурасиге и Скуг для культивирования стеблевых узлов ячменя и овсап/п 1 2 3 4 5 6 2 Компоненты Макросоли МС Микросоли МС-хелат Тиамин НС Мезо-инозит 6-БАП Культивирование проводят при температуре 2526, влажности 70 и световом фотопериоде 18 часов. На 8-10 сутки отмечалось появление побегов с 1-2 листочками и колоском. Образовавшиеся Таблица 2 побеговп/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Количество 1,46 мг/л 30 000 мг/л 7000 мг/л 5,6 побеги переносили на питательную среду для укоренения растений МС с содержанием ИУК - 2,0 мг/л (таблица 2).- Состав питательной среды Мурасиге Компоненты Макросоли МС Микросоли МС-хелат Тиамин НС 1 Мезо-инозит Кинетин или зеатин ИУК СаС 2.2 Н 2 Сахароза Агар Результаты побегообразования из узлов ячменя и овса на питательной среде МС приведены в таблице 3. При микроклональном размножении все изучаемые сорта давали начало как каллусогенезу, так и образованию побегов. Побегообразование у изучаемых сортов колебалось в пределах 45-75,укоренение побегов было наилучшим у сорта овса Никола от 80 до 100. Таблица 3 Каллусообразующая и побегообразующая способность стеблевых узлов ячменя и овса Сорт Количество Количество Побегообразо Количество Метод микроклонального размножения зерновых культур из сегментов растений ускоряет процесс получения растений-регенерантов, из которых создается селекционный материал. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ микроклонального размножения ячменя и овса, включающий культивирование и субкультивирование узлов на питательной среде для морфогенеза, отличающийся тем, что проводят стерилизацию узлов стебля и их культивирование на питательной среде Мурасиге и Скуг с добавлением мезоинозита - 100 мг/л, 6-БАП-2,0 мг/л, с последующим образованием на 28-30 сутки полноценных растений, при температуре 25-26,влажности 70 и световом фотопериоде 18 часов,на питательной среде Мурасиге и Скуг с добавлением ИУК - 2,0 мг/л.