Способ ускоренного получения растений-регенерантов картофеля in vitro

(51) 01 4/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ исследованиях по фитопатологии и морфогенезу картофеля. Способ состоит в том, что на первом этапе первичный каллус, индуцированный из эксплантовклубневых дисков и эксплантов-стеблей пробирочных растений,культивируют на питательной среде Мурасиге и Скуга, включающей 1,0-1,5 мг/л 6-БАП до получения растенийрегенерантов при температуре 25-26 С, постоянном освещении интенсивностью 5 000-10 000 лк лампами ДРЛ мощностью 400 Ватт в камере искусственного климата,на втором этапе полученные из каллуса микропобеги, отделяют и переносят на жидкую безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга с 2 сахарозы для укоренения и микроклонального размножения. Способ отличается объектом исследований и может быть успешно использован при ускоренном создании исходного материала для селекции салатного картофеля с использованием менее дорогостоящих питательных сред(72) Куаншбекова Марал Кадылбековна Мазурок Виталий Васильевич Москаленко Виктория Михайловна Темирова Индира Жанатовна Хасанов Вадим Тагирович Швидченко Владимир Корнеевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ УСКОРЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ КАРТОФЕЛЯ(57) Изобретение относится к сельскому хозяйству в частности к селекции и биотехнологии растений и может применяться при создании генетического разнообразия в культуре клеток и тканей растений, в отмечают появление корней см. Калашникова Е.А.,Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум Сельскохозяйственная биотехнология, Москва,2006, С. 35-36, 152. Общим недостатком применяемых способов получения растений- регенерантов картофеляявляется длительность культивирования каллусных культур на питательных средах с добавлением различных фитогормонов для регенерации побегов, а также их дальнейшего укоренения. Из всех известных способов наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является способ регенерации растений из каллусных культур,культивируемых на среде с добавлением 1 мг/л зеатина, 0,1 мг/л ИУК, 2,4 сахарозы, 1,0 глюкозы при интенсивности освещения 3000 лк,относительной влажности воздуха 70 и температуре 20-25 С. К недостаткам известного способа также следует отнести длительность сроков получения растенийрегенерантов, дороговизну фитогормонов в составе питательных сред для их укоренения и микроклонального размножения. Технической задачей изобретения является сокращение сроков получения растенийрегенерантов, упрощение процесса их укоренения и размножения, которое достигается путем пересадки первичного каллуса на питательную среду Мурасиге и Скуга для регенерации растений,включающую 1,0-1,5 мг/л 6- БАП, 2 сахарозы и культивирование при температуре 25-26 С,постоянном освещении интенсивностью 5 000-10 000 лк лампами ДРЛ мощностью 400 Ватт в камере искусственного климата. Полученные из каллуса микропобеги, отделяют и переносят на жидкую безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга с 2 сахарозы, на которой они успешно укореняются, растут, после чего их черенкуют до необходимого количества. Для получения растений-регенерантов применяли питательные среды для регенерации растений картофеля, включающие 0,5, 1,0, 1,5 мг/л 6-БАП. Контроль - среда Мурасиге и Скуга с добавлением 1 мг/л зеатина и 0,1 мг/л ИУК (таблица 1). Таблица 1 Состав питательных сред Мурасиге-Скуга для индукции органогенеза в культуре каллусной ткани картофеля Изобретение относится к сельскому хозяйству в частности к селекции и биотехнологии растений и может применяться при создании генетического разнообразия в культуре изолированных клеток и тканей растений, в исследованиях по фитопатологии и морфогенезу картофеля. Известен способ получения растенийрегенерантов картофеля, при котором каллусную ткань 5-го пассажа переносят в пробирки на агаризованную питательную среду Мурасиге и Скуга для морфогенеза, включающую 0,1 мг/л ИУК,0,35- 0,45 мг/л зеатина, 2 сахарозы и культивируют при 23-25 С днем и 18-20 С ночью,16-часовом фотопериоде, освещенности 6-8 тыс. люкс, создаваемой лампами ЛФР 150. Через 2 месяца культивирования на каллусах появляются регенераты высотой 5-10 мм см. О.С. МеликСаркисов и В.А. Аветисов. А.С. Способ получения микроклубней картофеля. 29.02.88, Бюл. 8. Известен способ массового получения регенерантов картофеля из первичного каллуса,культивируемого на питательной среде МурасигеСкуга с добавлением 0,1 мг/л ИУК и 0,05 мг/л 6 БАП. При этом каллус, ранее индуцированный из экс- плантов - клубневых дисков сортов Карла и Ора в весенний и осенний периоды на 40-е сутки культивирования в условиях освещенности 6000 лк и температуры 25 С отличался переходом к побегообразованию. Полученные регенеранты укореняют на среде с добавлением 0,1 мг/л ИУК см. И.М. Суриков, Г.М. Цилосани. Массовое получение регенерантов картофеля из первичного каллуса. Физиология и биохимия культурных растений, том 12, 6, 1980, с. 653-657. Известен способ регенерации растений картофеля из каллусных культур при культивировании каллуса на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга для индукции морфогенеза, включающей 1 мг/л зеатина, 0,1 мг/л ИУК, 2,4 сахарозы, 1,0 глюкозы при интенсивности освещения 3000 лк, относительной влажности воздуха 70 и температуре 20-25 С. При этом через 4-7 недель отмечается появление апексов, которые при дальнейшем культивировании превращаются в микропобеги. Когда они достигнут высоты 10 мм, их отделяют от каллусной ткани и переносят на среду для укоренения. Через 5-10 дней Компоненты питательной среды Минеральные элементы Гидролизат казеина Аденин Мезоинозит Тиамин Пиридоксин Глицин Никотиновая кислота Биотин 2 Компоненты питательной среды Фолиевая кислота Зеатин 6-БАП ИУК Сахароза Глюкоза Агар-агар 5,7 Сущность предлагаемого способа раскрывается следующими примерами. Пример 1. Полученные из эксплантов клубневых дисков каллусы 3-го пассажа салатных сортов картофеля,переводят на питательные среды для регенерации растений, включающие 1 мг/л зеатина, ОД мг/л ИУК (В-1), 2,5 мг/л 6-БАП (В-2) (таблица 2). Таблица 2 Регенерационная способность каллусных культур картофеля салатного направления на питательных средах МС с различными фитогормонами (экспланты - клубневые диски) В проводимых исследованиях на 30-е сутки культивирования каллуса картофеля сортана среде, включающей 2,5 мг/л 6-БАП отмечено формирование морфогенных структур и единичная регенерация растений. Регенерации растений картофеля сортане наблюдалось. Пример 2. Полученные из эксплантов - клубневых дисков и эксплантов - стеблей пробирочных растений первичные каллусы салатных сортов картофеля,переводят на питательные среды для регенерации растений, включающие 1 мг/л зеатина (В-1) и несколько меньшие концентрации 6 БАП 0,5 мг/л, 1,0 мг/л, 1,5 мг/л 6-БАП (В-2-3). Данные по изучению действия различных концентраций 6-БАП на регенерационную способность каллусных тканей,ранее индуцированных из различных эксплантов салатных сортов картофеля приведены в таблице 3. Результаты проведенных исследований, согласно данным таблицы 3, показали, что на 15-20-е сутки культивирования на питательной среде Мурасиге и Скуга с добавлением 1,5 мг/л 6-БАП отмечена относительно высокая регенерационная способность(50-75) каллусных культур изучаемых салатных сортов картофеля. Следует отметить,что регенерационная способность эксплантов - стеблей пробирочных растений была выше, чем на эксплантах- клубневых дисках у обоих сортов картофеля. Изучаемые сорта картофеля вне зависимости от сезонности были способны к регенерации растений из каллуса, культивируемого на среде с внесением и 1,0 мг/л 6-БАП. Меньшие концентрации 6-БАП, как и контрольный вариант опыта не оказали положительного влияния на регенерацию растений салатных сортов картофеля. Таблица 3 Регенерационная способность каллусных культур, индуцированных из стеблевых и клубневых эксплантов картофеля салатного типа на питательной среде МС с различными концентрациями 6-БАП Сорт / эксплант Полученные растения-регенеранты были отделены от каллусной ткани и переведены из чашек Петри в пробирки на жидкую безгормональную среду Мурасиге и Скуга с 2 сахарозы, на которой они успешно укоренялись, дорастали до пробки и через 3-4 недели были размножены методом микрочеренкования на аналогичной питательной среде. Оставшаяся каллусная ткань использовалась для повторной регенерации растений на свежей модифицированной питательной среде для морфогенеза с добавлением 1,5 мг/л 6-БАП. Результаты сравнительного биометрического анализа растений-регенерантов сортови, индуцированных из каллусных культур представлены в таблице 4. Таблица 4 Биометрический анализ растений-регенерантов сортов картофеля салатного типа на 15-е сутки культивирования на жидкой и агаризованной безгормональной питательной среде МС Сорт/среда/жидкая/агаризованная ВС /жидкая ВС /агаризованная Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что по всем изучаемым показателям рост растенийрегенерантовпротекал интенсивнее на жидкой питательной среде по сравнению с агаризованной питательной средой. Таким образом, срок получения растенийрегенерантов из каллуса картофеля предлагаемым способом по сравнению с прототипом сокращается в 2 раза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ ускоренного получения растенийрегенератов картофеля, включающий культивирование каллусной ткани, индуцированной из эксплантов - клубневых дисков на агаризованной питательной среде для морфогенеза, отличающийся тем, что на первом этапе первичный каллус,индуцированный из эксплантов - клубневых дисков и эксплантов-стеблей пробирочных растений культивируют на питательной среде Мурасиге и Скуга, включащей 1,0-1,5 мг/л 6-БАП до получения растений-регенерантов при температуре 25-26 С,постоянном освещении - 5000-10000 лк лампами ДРЛ мощностью 400 Ватт в камере искусственного климата, на втором этапе полученные из каллуса микропобеги, отделяют и переносят на жидкую безгормональную питательную среду Мурасиге и Скуга с 2 сахарозы для укоренения и дальнейшего микроклонального размножения.