Способ получения микроклубней картофеля in vitro

(51) 01 3/00 (2010.01) 01 4/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ(57) Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности, к способу получения микроклубней картофеля в условиях. Технической задачей изобретения является сокращение времени получения микроклубней картофеля в условиях, которая достигается за счет высадки одноузловых черенков пробирочных растений картофеля на агаризованную питательную среду, содержащую 80 000 мг/л сахарозы и по 1 мг/л 6-БАП и кинетина, и культивирование их при 16-часовом фотопериоде и температуре 25 С, с последующим переносом регенерантов на вторые-третьи сутки в условия полной темноты при температуре 18-20 С. Предлагаемая технология выращивания микроклубней позволяет сократить сроки получения безвирусного посадочного материала картофеля в лабораторных условиях до 5 суток.(72) Бабаев Сайлау Ахметович Швидченко Владимир Корнеевич Хасанов Вадим Тагирович Токбергенова Журсинкуль Абдугаппаровна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) А.с. СССР 1376990, кл. А 01 Н 3/00, 1988 Есипова З.И. Клубнеобразование, как способ получения посадочного материала в первичном семеноводстве картофеля// Селекция и семеноводство, 1987,3, с.51-5351371, кл. А 01 Н 3/00, А 01 Н 3/02, 1993 Предварительный патент РК 10152, кл. А 01 Н 4/00, 2001 Патент РФ 2075289, кл.А 01 Н 4/00, 12 5/00, 19972052925, кл. А 01 Н 4/00, 2002 24419 Изобретение относится к сельскому хозяйству,биотехнологии и семеноводству картофеля, в частности к способу выращивания пробирочных клубней картофеля на агаризованной питательной среде с внесением 6-бензиламинопурина (БАП) и 6 фурфуриламинопурина (кинетина). Известен способ выращивания микроклубней картофеля (см. Есипова З.И. Клубнеобразованиекак способ получения посадочного материала в первичном семеноводстве картофеля // Ж. Селекция и семеноводство,1987, 3,с.51-53),заключающийся в том, что расчеренкованные растения помещают на три недели в условия десятичасового фотопериода при освещенности 3,54,0 клк, затем переводят растения в условия полной темноты на 3-7 суток. После этого, для получения микроклубней, пробирочные растения выращивают 1,5-2 месяца при 16-часовом фотопериоде и 3,0 клк. Кроме того, известен способ ускоренного получения микроклубней (см. Трофимец Л.Н.,Остапенко Д.П., Бойко В.В. и др. Оздоровление и ускоренное размножение семенного картофеля // Методические рекомендации, М, 1985, с.36),который осуществляют путем выдерживания растений после черенкования в течение 12 суток при обычном 16-часовом фотопериоде и дальнейшим переводом на 30-45 дней на короткодневный - 1012- часовой фотопериод. Известен способ получения микроклубней картофеля(см. А.с.1376990, кл. А 01 Н 3/00, Бюл.8, 1988 г.), сущность которого заключается в выращивании каллусной ткани с зачатками регенерантов (5-10 мм) на питательной среде Мурасиге и Скуга, обогащенной 80000-90000 мг сахарозы с дополнительным внесением в питательную среду 0,35-0,45 мг/л зеатина в обычных условиях при 18-20 С ночью, 23-25 С днем, 16-часовом фотопериоде и освещенности 6-8 тыс. лк. Приведенный способ по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту является наиболее близким техническим решением (прототипом). Общим недостатком технологий культивирования является длительность получения микроклубней картофеля. Технической задачей изобретения является устранение указанного недостатка, т.е. сокращение времени получения микроклубней,который заключается в том, что черенкование пробирочных растений и дальнейшее культивирование одноузловых черенков на питательной среде,содержащей 8 сахарозы,1 мг/л 6 бензиламинопурина, 1 мг/л кинетина осуществляют на свету при 16-часовом фотопериоде, температуре 25 С с последующим переносом регенерантов на вторые-третьи сутки в условия полной темноты и выращивают их при температуре 18-20 С. Сущность предложенного способа иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Меристемные растения, достигшие высоты пробирки, черенкуют в стерильных условиях. Полученные черенки помещают в большие пробирки с 20 мл ага-ризованной питательной среды с минеральной основой по Мурасиге и Скугу(МС), содержащей 8 сахарозы, 1 мг/л 6 бензиламинопурина, 1 мг/л кинетина. Контроль агаризованная питательная среда МС с 8 сахарозы,1 мг/л гибберелловой кислоты и 1 мг/л ИУК, рН 5,7(таблица 1, В-1,2). Таблица 1 Состав питательных сред, используемых для клубнеобразования(мг/л) Компоненты В-1 (МС, контроль) В-2 В-3 В-4 Макросоли 1650 1650 1650 43 1650 1900 1900 1900 3 1900 440 440 440 СаС 2 х 2 Н 2 О 440 Са 2(3)2 370 370 3704 7 Н 2 О 370 170 170 170 КН 2 РО 4 170 37,3 37,3 37,32 ЭДТА 37,3 27,8 27,8 27,8 472 27,8 Микросоли 6,2 6,2 6,2 Н 3 ВО 3 6,2 22,3 22,3 22,34 х 4 Н 2 О 22,3 8,6 8,6 8,6 442 8,6 Продолжение таблицы 1 Гибберелловая кислота Кинетин ИУК 6-БАП Гидролизат казеина Сахароза Агар В первый день культивирование одноузловых черенков ведут при 16-часовом фотопериоде,освещенности 3000-5000 лк и температуре 25 С. На второй-третий день регенеранты помещают в условия полной темноты и выращивают при температуре 18-20 С. На пятый день на регенерантах начинают образовываться микроклубни, достигающие к концу недели размеров 37 мм и более (Индукция микроклубней на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга, включающей 1 мг/л кинетина, 1 мг/л 6-БАП и 8 сахарозы). Повышение концентрации сахарозы и добавление в агаризованную питательную среду 6 БАП и кинетина в концентрации 1 г/л чаще вызывает пазушное клубнеобразование на черенках без отрастания корней и побегов. Повышение концентрации 6-БАП в данной питательной среде до 2 мг/л, как будет указано в примере 2, ингибирует процесс клубнеобразования. Найденные закономерности были проверены на эксплантах различных сортов картофеля Аксор, Бакша, ,Тамаша и Невский. Большинство изучаемых сортов картофеля при добавлении 6-БАП в концентрации 1 мг/л отличаются от контроля (В-1) по выходу микроклубней. Добавление в среду 6-БАП в указанной концентрации не оказывает никакого влияния на выход микроклубней сорта(таблица 2). Особенностью клубнеобразования сортов Бакша и Аксор на питательной среде с добавлением 2 мг/л 6-БАП и 1 мг/л кинетина, является образование 2-5 микроклубней, причем на многих растениях отмечается образование цепочек микроклубней(совокупностей), т.е. из ростка первого микроклубня формируются микроклубни второго, третьего и т. д. порядка. Максимальный процент клубнеобразования(80), отмечен у сорта Аксор на среде МС 6 БАПкинетин, в отличие от стандартной среды МС(40). Самый низкий выход микроклубней (10-30) отмечен у сорта Тамаша, но и у этого сорта под влиянием 6-БАП количество микроклубней возросло, по сравнению с контролем, в 3 раза. Таблица 2 Влияние 6-БАП и кинетина в концентрации 1 мг/л на клубнеобразованиеклубнеобразования от 10 микрочеренков на 10 сутки 20 сутки 30 сутки 40 сутки МС МС 6 МС МС 6 МС МС 6 МС МС 6-БАП БАП БАП БАП 0 10 0 20 0 25 10 30 30 50 40 60 40 70 40 80 30 20 40 40 40 50 40 60 20 20 30 30 30 30 30 30 30 30 50 60 50 65 50 70 1,4 7,6 5,7 4,3 5,7 3,8 5,3 3,3 0,5 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 Пример 2. Пробирочные растения черенкуют тем же способом, что и в примере 1. Отличие - фитогормон 6-БАП вносят в питательную среду в концентрации 2 мг/л (таблица 1, В-3). Условия культивирования те же, что и в примере 1. В рассматриевом примере при изучении влияния 6-БАП на клубнеобразованиесортов Невский, Аксор, Бакша, , Тамаша наблюдали 2 типа клубнеобразования клубнеобразование на столонах и в пазухах листьев. При столонном клубнеобразовании по количеству и размерам микроклубней все сорта превосходили сорт Невский (таблица 3). Таблица 3 Анализ столонного клубнеобразованияпри 052,23 Сорт Количество Длина Количество Размеры микроклубней столонов,столонов,микроклубней на 1 длина, мм ширина, мм шт. мм растение, шт. Тамаша 3,00,30 3,80,19 3,00,30 6,50,45 3,00,26 ф 10,0 20,0 10,0 14,4 11,5 Аксор 1,10,10 2,00,12 1,10,10 4,50,17 3,00,21 ф 11,0 16,6 11,0 26,4 14,2 Бакша 1,40,16 7,20,34 1,40,16 4,00,42 2,80,25 ф 8,75 21,2 8,8 9,5 11,2(контроль) ф 11,0 11,7 11,0 9,52 14,2 Примечание 1 - 05- нормированное отклонение критерия Стьюдента при числе степеней свободы равном 9 ф -соотношение среднего арифметического к его абсолютной ошибке. Как видно из таблицы 3, максимальный размер, а также количество столонов (2 шт.) и микроклубней(3 шт.) на одно растение отмечены у сорта Тамаша. По длине столонов сорт Тамаша превосходил сорт Аксор на агаризованной питательной среде, а по остальным показателям (количество микроклубней Таблица 4 Анализ пазушного клубнеобразованияпри 052,23 Среднее количество микроклубней Размеры микроклубней на 1 растение длина, мм ширина, мм 1,00 6,800,71 2,600,26 9,5 10,0 1,00 5,500,57 3,080,19 9,6 16,21 1,00 5,430,72 2,360,24 7,5 9,8 1,500,22 3,800,39 3,000,21 6,8 9,7 14,2 1,070,0 4,060,40 2,600,21 15,2 10,2 12,3 Как видно из таблицы 4, несколько большее количество микроклубней наблюдалось у сорта. В целом повышение концентрации БАП и кинетина в концентрациях 2 мг/л и 1 мг/л БАП у сортов Аксор, Бакша, , Тамаша и Невский ведет к отставанию процесса клубнеобразования, по сравнению с вариантом МСБАП-1 мг/л, кинетин 1 мг/л и контрольным вариантом. Если при введении в питательную среду 6-БАГТ в концентрации 1 мг/л начало клубнеобразования наблюдалось на 5-е сутки (пример 1), то в данном случае образование микроклубней наступало лишь через 1-1,5 месяца в зависимости от генотипа картофеля. Так, наиболее раннее клубнеобразование было у раннеспелого сорта Тамаша и средне-ранних сортов Бакша и Невский, а также у среднеспелого сорта Аксор. У сортапервые микроклубни появились только через 1,5 месяца после черенкования. Через два месяца от начала культивирования одноузловых черенков процент клубнеобразования у сортов Аксор, Невский, Бакша, , Тамаша составил 80,70, 60, 30, и 30 соответственно. Пример 3. 4 и столонов, размеры микроклубней) особых отличий не выявлено. При исследовании клубнеобразования в пазухах листьев отмечено, что у всех сортов образовалось по одному микроклубню на растение (таблица 4). Меристемные растения картофеля с 4-5 междоузлиями черенкуют в ламинар-боксе в асептических условиях и пересаживают в конические колбы (на 100 мл) с агаризованной питательной средой,приготовленной на минеральной основе по Мурасиге-Скугу,содержащей 80 000 мг/л сахарозы и 0,04 мг/л кинетина (таблица 1, В-4). Первые 2-3 дня черенки культивируются при 16 часовом фотопериоде и температуре 22-25 С. На четвертый день растения помещаются в условия темноты и выращивают при такой же температуре(22-25 С). На шестой-седьмой день на растениях наблюдается начало индукции микроклубней, а на 9-10 сутки микроклубни достигают размеров 6-8 мм и более. Согласно результатам проведенных исследований, предлагаемый способ по размеру микроклубней и проценту клубнеобразования превосходил стандарт в 1,5-2 раза. В изучаемом эксперименте у всех испытуемых сортов на одно растение образовалось в среднем по 2-3 микроклубня. При этом микроклубни индуцировались в пазухах листьев. По количеству и размерам микроклубней с одного растения все изучаемые сорта картофеля превышали контроль. Максимальный размер микроклубней отмечен у сорта Аксор. Наиболее высокий процент клубнеобразования (100) наблюдался у сорта Бакша (таблица 5). Таким образом, из вышеприведенных способов ускоренного производства безвирусного предбазисного посадочного материала картофелянаиболее оптимальным является способ получения микроклубней картофеля на 5-е сутки на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга,содержащей 1 мг/л 6-БАГЛ и кинетина, 8 сахарозы при 16-часовом фотопериоде,освещенности 3000-5000 лк и температуре 25 С в первые сутки культивирования и в условиях полной темноты, температуре 18-20 С - на вторые-третьи сутки культивирования одноузло-вых черенков пробирочных растений картофеля. Таблица 5 Индукция пазушного клубнеобразованияу различных сортов картофеля на агаризованной среде Мурасиге и Скуга, содержащей 8 сахарозы и 0,04 мг/л кинетина на 10-е сутки при 052,09 Наименование Вариант питательной среды сортов В-1 (стандарт) В-4 Среднее кол-во размер,клубнеСреднее кол-во размер,клубнемикроклубней на 1 мм образования микроклубней на 1 мм образования растение, шт. растение, шт. Тамаша 2,30,24 4,00,42 45 2,50,16 6,00,62 80 ф 9,8 9,5 15,8 9,6 Аксор 2,00,21 4,60,94 40 2,00,22 8,51,20 80 ф 9,52 4,8 9,8 7,1 Бакша 2,30,24 4,50,17 55 3,00,05 7,61,10 100 ф 9,8 26,4 62,8 6,9 2,00,30 4,20,36 50 2,00,17 6,10,60 75 ф 6,6 11,6 11,7 10,1 Невский (конт.) 1,40,16 3,80,39 30 1,50,22 5,20,63 60 ф 8,7 9,7 6,8 Примечание 2 - 05 - нормированное отклонение критерия Стьюдента при числе степеней свободы равном 19 ф - соотношение среднего арифметического к его абсолютной ошибке. Срок получения микроклубней по предлагаемому способу,по сравнению с прототипом, сокращается в 3-4 раза. Таких результатов невозможно достичь без применения данного сочетания цитокининов и сахарозы. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения микроклубней картофеля растений и высадку одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую сахарозу, отличающийся тем, что культивирование одноузловых черенков на питательной среде,содержащей 8 сахарозы, 1 мг/л 6 бензиламинопурина, 1 мг/л кинетина осуществляют на свету при 16-часовом фотопериоде, температуре 25 С, с последующим переносом регенерантов на вторые-третьи сутки в условиях полной темноты и выращивают их при температуре 18-20 С.