Способ сохранения каллусных культур пшеницы in vitro

(51) 01 4/00 (2010.01) 12 5/04 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ стерилизации зерновок пшеницы и вычленения из них незрелых зародышей, формирования из них на 20-25-е сутки при температуре 26 С, влажности 6070 и условий темноты каллусных тканей, которые культивируют в течение 1-12 месяцев на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга с содержанием 6 сахарозы и 1-5 мг/л 2,4-Д в холодильной камере при температуре 4 С с последующим переносом их при необходимости использования на среду для регенерации растений в условия 16-часового фотопериода, температуры 2526 С, влажности 60-70 и освещенности 5 тыс. люкс. Предлагаемый способ сохранения каллусных культур пшеницыпозволяет без использования регулярного пассирования и дополнительных затрат на химические реактивы добиться упрощения технологии и увеличения сроков хранения каллусных тканей в условиях пониженных температур, не снижая при этом их морфогенетической способности.(72) Швидченко Владимир Корнеевич Хасанов Вадим Тагирович Каманова Светлана Георгиевна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ПШЕНИЦЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии растений в частности к сохранению генофонда зерновых культур и может применяться при длительном хранении каллусных тканей пшеницы. Технической задачей изобретения является повышение жизнеспособности каллусных культур пшеницы, которая достигается за счет 24420 Изобретение относится к биотехнологии растений в частности к сохранению генофонда зерновых культур и может применяться при длительном хранении каллусных тканей пшеницы. Известен способ длительного хранения незрелых эмбрионов пшеницы (см. А.с.1606045, кл. А 01 Н 4/00, бюл.42, 1990 г.), который состоит в их предварительной подготовке, дегидратации и замораживании, при этом семена пшеницы через 1620 сутки после самоопыления помещают в 0,30,75-ный раствор диметилсульфоксида (ДМСО) на 20-24 ч, после чего осуществляют дегидратацию в вакуумном эксикаторе с СаС 2 при температуре (2 4)С. При уменьшении влажности незрелых семян до 20-25 их криоконсервируют путем помещения в пары жидкого азота, после чего погружают в жидкий азот. Отогрев проводят на водяной бане при 40 С. Жизнеспособность эмбрионов при их культивировании на среде Гамборга В 5. Жизнеспособность незрелых эмбрионов составляла 67,8. Недостатком известного способа является применение дорогостоящих реактивов и оборудования, а также низкая жизнеспособность эмбрионов после криоконсервации. Кроме того, известен способ сохранения каллусных культур полученных из незрелых зародышей пшеницы. Способ заключается в пассировании каллуса в течение 5-пассажей каждые 25-30 дней на свежую питательную среду Мурасиге и Скуга включающей 2,0 мг/л 2,4-Д и 3 сахарозы. При этом культивирование каллусных культур пшеницы осуществляется в термостате при температуре 25-26 С и влажности 60-70 (см. Бутенко Р.Г., Никифорова И.Д., Швидченко В.К. // Методические указания по использованию морфогенетического потенциала культивируемых клеток незрелых зародышей в, Целиноград,1987 г., с.45). Недостатком указанного способа является уменьшение регенерационной способности каллусных культур пшеницы после 5-го пассажа и трудоемкость работ с культурой ткани растений. Известен способ длительного сохраненияжизнеспособности растений (см. А.с.1630708, кл. А 01 Н 4/00, бюл.8, 1991 г.) без пересадки на свежие питательные среды и без внесения дополнительных доз свежего питательного раствора в первоначальную среду в период хранения. Способ состоит в том, что растения, полученные при микроклональном размножении, помещают в пробирки, закрытые ватными пробками, на модифицированную питательную среду МурасигеСкуга, содержащую 1-4 мг/л маннита, и при соотношении в среде ионов аммония и нитратных ионов 1(30,5), при этом пробирки запаивают в полиэтиленовую пленку и культивируют при комнатной температуре. При использовании данного способа хранения жизнеспособность растений сохраняется на уровне 100 в течение 3-х месяцев. На 5-й месяц хранения количество живых растений снижается до 40. Недостатком данного способа является недостаточно длительное хранение растений. Известен способ сохранения незрелых эмбрионов пшеницы путем длительного культивирования эмбриогенных каллусных тканей пшеницы, который заключается в том, что каллусные ткани получают из незрелых зародышей пшеницы на питательной среде МС включающей 2,4-Д в концентрации 5 мг/л, каллус многократно культивируют при температуре 24 С, 16 часовом фотопериоде. В последующих субкультивированиях отбирают плотный эмбриогенный каллус, который культивируют на модифицированной среде МС с 2,4-Д в концентрации 1 мг/л, мальтозой - 30 мг/л,гидролизатом казеина и пролином - 500 мг/л. Культивируемый каллус обладает 100 регенерационной способностью в течение 10-12 пассажей (см. Амирова А.К., Соматический эмбриогенез и регенерация растений в длительно культивируемых каллусных тканях пшеницы,Автореферат канд. дис, Алматы, 2004 г., с.34). Приведенный способ по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту является наиболее близким техническим решением(прототипом). Недостатком известного способа является трудоемкость работ по периодическому пассированию каллусных культур на различные по составу питательные среды. Технической задачей изобретения является повышение жизнеспособности каллусных культур пшеницы, которая достигается за счет стерилизации зерновок пшеницы и вычленения из них незрелых зародышей, формирования из них на 20-25-е сутки при температуре 26 С, влажности 6070 и условий темноты каллусных тканей, которые культивируют в течение 1-12 месяцев на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга с содержанием 6 сахарозы и 1-5 мг/л 2,4-Д в холодильной камере при температуре 4 С с последующим переносом их при необходимости использования на среду для регенерации растений в условия 16-часового фотопериода, температуры 2526 С, влажности 60-70 и освещенности 5 тыс. люкс. Сущность предложенного способа иллюстрируется следующим образом. Для индукции каллусав качестве экспланта используют зародыши незрелых зерновок пшеницы. Донорные растения выращивают как в полевых, так и в тепличных условиях. На 19-25-е сутки при выращивании растений в полевых условиях и на 1417-е сутки при выращивании в тепличных условиях после фазы цветения растения срезают. После чего зерновки освобождают от цветочных и колосковых чешуи и помещают в марлевый мешочек для стерилизации. В асептических условиях проводят вычленение незрелых зародышей, которые переносят в чашки Петри на среду Мурасиге и Скуга для культивирования с различным содержанием 2,4-Д и 6 сахарозы (табл. 1). Состав питательной среды Мурасиге и Скуга для длительного культивирования каллуса пшеницы Компоненты Количество 2 3 Макросоли 50 мл/л Микросоли 1,0 мл/л Культивирование незрелых зародышей проводят в холодильной камере при температуре 4 С в течение 1, 6 и 12 месяцев. Контрольным вариантом послужила питательная среда Мурасиге и Скуга без гормонов. На 20-25 сутки культивирования изолированных незрелых зародышей пшеницы на агаризованной питательной среде для каллусообразования в условиях 60-70 влажности, темноты и температуре 25-26 С (термостат) отмечалась индукция каллуса. Образовавшийся каллус культивировали в течение 1, 6 и 12 месяцев в холодильной камере при температуре 4 С и темноте, затем его переносили на среду для регенерации растений (табл. 2) и культивировали в факторостатной комнате при 16 часовом фотопериоде, температуре 25-26 С,влажности 60-70 и освещенности 5 тыс. люкс. Таблица 2 Состав питательной среды Мурасиге и Скуга для регенерации растении Компоненты Количество Макросоли 50 мл/л Микросоли 1,0 мл/л Результаты каллусообразующей способности незрелых зародышей пшеницы на питательной среде Мурасиге и Скуга с различными концентрациями 2,4-Д в условиях пониженных температур приведены в таблице 3. Таблица 3 Оценка каллусообразующей способности незрелых зародышей пшеницы на агаризованной питательной среде с 2,4-Д после хранении при температуре 4 С Сорт Концентрация Кол-во культивируемых Кол-во образовавшегося каллуса по месяцам 2,4- Д, мг/л эксплантов по месяцам, шт. 1 м. 6 м. 12 м. 1 м. 6 м. 12 м. шт. Как видно из таблицы 3, все изучаемые варианты опыта имели высокий процент каллусообразования и превосходили контроль. Наиболее оптимальной для выхода каллуса пшеницы сортов Астана 2 и Карабалыкская 8 являлась питательная среда с добавлением 3 мг/л 2,4-Д. Каллусообразующая способность у обоих сортов пшеницы на данной питательной среде составила 100. При культивировании незрелых зародышей в условиях пониженных температур у большинства изучаемых вариантов опыта выход каллуса практически не снижался и находился в пределах от 13,3 до 30 на среде без гормонов и от 86,7 до 100 на средах с различными концентрациями 2,4-Д. С целью оценки морфогенетической способности каллусы, сохраняемыев течение 1, 6 и 12 месяцев при температуре 4 С переносили на среду для регенерации растений и культивировали в факторостатной комнате. Под морфогенетической способностью в данном случае понимается образование меристематических очагов,в которых формируются зачатки стеблей или корней. Изначально это проявлялось в позеленении каллусной ткани. Результаты оценки морфогенетической способности каллусных тканей пшеницы на питательной среде для регенерации растений представлены в таблице 4. Согласно представленным в таблице данным, все изучаемые варианты опыта, как и в случае изучения каллусообразующей способности превосходили контроль. Морфогенетическая способность каллусных тканей изучаемых сортов пшеницы была высокой и находилась в следующих пределах при хранении 1 месяц - от 44 до 96,4, 6 месяцев хранения - от 81,5 до 93,3 и на 12 месяц хранения -65,5 - 88,9. Таким образом, предлагаемый способ позволяет без использования регулярного пассирования добиться увеличения сроков хранения каллусных тканей пшеницы в культуре ткани растений в условиях пониженных температур, не снижая при этом их способности к формированию морфогенных клеточных структур. Таблица 4 Оценка морфогенетической способности каллусных тканей пшеницы,культивируемых при 4 С в течение 1, 6 и 12 месяцев Сорт Концентрация Количество культивируемого вирус Количество образовавшегося 2,4-Д, мг/л каллуса на МС регенерация, шт. морфогенного каллуса 1 м. 6 12 м. 1 м. 6 м. 12 м. м. шт. Астана 2 Без гормонов 25 20 30 0 0 0 1,0 27 28 27 24 88,9 25 89,3 24 88,9 2,0 29 27 26 26 89,7 23 85,2 22 84,6 3,0 30 30 30 28 93,3 28 93,3 27 90 4,0 28 30 29 27 96,4 27 90 25 86,2 5,0 30 29 28 25 83,3 24 82,8 21 75 Карабалыкская Без гормонов 9 6 7 4 44,4 0 0 8 1,0 28 29 26 24 85,7 25 86,2 22 84,6 2,0 27 28 30 23 85,1 24 85,7 27 90 3,0 30 30 30 28 93,3 26 86,7 25 83,3 4,0 30 30 30 27 90 26 86,7 21 70 5,0 30 27 29 22 73,3 22 81,5 19 65,5 Кроме облегчения работ при однократном введении эксплантов незрелых зародышей пшеницыи, следовательно, значительной экономии химических реактивов для культивирования трансплантов, предлагаемый способ позволяет в нужный момент использовать каллус пшеницы для микроклонального размножения,получения растении-регенерантов и создания селекционного материала. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ сохранения каллусных культур пшеницы, включающий стерилизацию зерновок пшеницы и вычленение из них незрелых зародышей,формирование из них на 20-25-е сутки при температуре 26 С, влажности 60-70 и условий темноты каллусных тканей, отличающийся тем,что полученные из эмбрионов каллусные культуры культивируют в течение 1-12 месяцев на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга с содержанием 6 сахарозы и 1-5 мг/л 2,4-Д в 24420 холодильной камере при температуре 4 С с последующим переносом их при необходимости использования на среду для регенерации растений в