Способ получения фотосинтезирующей каллусной культуры пшеницы

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ К ПАТЕНТУ Технический результат - упрощение способа и повышение его эффективности за счет подбора оптимальных условий углеводного питания каллусных тканей на этапе культивирования на свету - достигается тем, что в способе получения фотосинтезирующей каллусной культуры пшеницы,включающем стерилизацию зерновок и культивирование зародышей зерен на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,4-Д, при температуре выше 20 С, согласно полезной модели, очищенные зерновки стерилизуют 70 этанолом с последующим промыванием водой,культивирование каллусной ткани сначала проводят в темноте при температуре 26 С на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2 мг/л 2,4-Д, через 2 недели культивирования их помещают на 20-25 суток на среду Мурасиге-Скуга,содержащую 5 мг/л 2,4-Д, а затем каллусы каждого вида пшеницы пересаживают на среду пролиферации каллусов - среду Мурасиге-Скуга,включающую 1 мг/л 2,4-Д и 20 г/л сахарозы и культивируют в течение одного месяца при температуре 20-26 С и постоянном освещении 3000 Лк.(72) Терлецкая Нина Владимировна Алтаева Назира Алтайызы Искакова Ажар Батырбековна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(74) Алчимбаева Раушан Темирхановна Бавлакова Анна Вячеславовна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ПШЕНИЦЫ(57) Полезная модель относится к области физиологии и биотехнологии растений и может быть использована в исследованиях по селекции и генетике растений для повышения эффективности получения растений-регенерантов различных видов пшеницы как перспективного селекционного материала. Полезная модель относится к области физиологии и биотехнологии растений и может быть использована в исследованиях по селекции и генетике растений для повышения эффективности получения растений-регенерантов различных видов пшеницы как перспективного селекционного материала. Известен способ культивирования эксплантов на каллусогенной питательной среде, включающий анализ ростовых процессов, отбор и регенерацию растений. В качестве эксплантов используют зародыши зрелых семян. Семена стерилизуют сначала в 70 - ном этиловом спирте в течение 20 минут, затем в 0,1 - ном растворе сулемы в течение 20 минут. Простерилизованные семена промывают 6 - кратно по 10 минут стерильной водой, после чего осуществляют посадку эксплантов Верхние половинки зародышей сажают на агаризованную питательную среду Гамборга В 5,содержащую 2,4 Д(Дихлорфенилуксусную кислоту). Культивирование эксплантов проводят при 16 - часовом фотопериоде, освещенности 10001500 лк, температуре 23-25 С в пробирках,содержащих по 25 мл питательной среды. При анализе ростовых процессов определяют содержание каллусов с высокой регенерационной способностью и побегов в общем объеме культур,причем оценку генотипов на устойчивость к неблагоприятным абиотическим факторам среды, в частности засухе, проводят по типу реакции эксплантов на каллусогенной среде при этом генотип относится к группе с повышенной или высокой устойчивостью, если доля культур с каллусами с высокой регенерационной способностью и доля культур с растениямирегенерантами в сумме составляют больше половины оцениваемых культур данного генотипа генотип характеризуется высокой устойчивостью,если доля культур с растениями-регенерантами составляет больше половины оцениваемых культур данного генотипа (Патент РФ 2146865, кл. А 01 Н 4/00, 2000). Недостатком данного способа является невысокий процент регенерации изучаемых сортов,необходимость обработки большого количества зерен (120-160 штук для каждого варианта),длительная подготовка эксплантов для асептического введения в культуру (280 минут) и длительное культивирование (90-120 дней). Наиболее близким к предлагаемому решению является способ получения фотосинтезирующей каллусной культуры, включающий культивирование зародышей зерен на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,4-Д. Сначала зерна в стадии молочно - восковой спелости стерилизуют 14 минут в 7,5 растворе гипохлорита натрия, промывают в дистиллированной воде последовательно в течение 5, 10 и 15 минут,вычленяют зародыши, высаживают их в пробирки объемом 5 мл на агаризованную среду МурасигеСкуга, содержащую 2,4-Д, культивируют при температуре 20-24 С при естественном освещении без досвечивания до достижения каллусами объема 2 не менее 125 мм 3 (обычно 20-25 дней), отбирают каллусы с побегами (не менее 20 штук). После удаления побегов отобранные каллусы по 8-10 штук высаживают в чашки Петри на агаризованную среду того же состава, но с уменьшенной концентрацией 2,4-Д и добавлением стрессового агента,обеспечивающего осмотическое давление 0,5 МПа,культивируют при освещенности 2,5-3,0 кЛк, при 16 часовом фотопериоде и температуре 20-24 С в течение 7 суток. С помощью флуориметра проводят регистрацию световых кривых скорости транспорта электронов (СТЭ) через фотосистему в диапазоне интенсивности возбуждающего света от 0 до 400 мкмоль фотонов/м 2 с, усредняют данные измерений всех каллусов одного сорта, строят для каждого сорта график зависимости скорости СТЭ от интенсивности возбуждающего света, оценивают засухоустойчивость генотипов по уровню интенсивности возбуждающего света, при котором световая кривая пересекает ось абсцисс. Чем выше этот уровень, тем более засухоустойчив генотип(Патент РФ 2560580, кл. А 01 Н 1/04, 2015,20.08.15.г). Недостатком данного способа является сложность осуществления и отсутствие связи получения фотосинтезирующей каллусной культуры с углеводным питанием, что снижает эффективность способа. Задачей полезной модели является усовершенствование способа получения фотосинтезирующей каллусной культуры различных видов пшеницы за счет ускоренной подготовки эксплантов и подбора оптимальных условий и углеводного питания каллусных тканей. Технический результат - упрощение способа и повышение его эффективности за счет подбора оптимальных условий углеводного питания каллусных тканей на этапе культивирования на свету - достигается тем, что в способе получения фотосинтезирующей каллусной культуры пшеницы,включающем стерилизацию зерновок и культивирование зародышей зерен на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,4-Д, при температуре выше 20 С, согласно полезной модели, очищенные зерновки стерилизуют 70 этанолом с последующим промыванием водой,культивирование каллусной ткани сначала проводят в темноте при температуре 26 С на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2 мг/л 2,4-Д, через 2 недели культивирования их помещают на 20-25 суток на среду Мурасиге-Скуга,содержащую 5 мг/л 2,4-Д, а затем каллусы каждого вида пшеницы пересаживают на среду пролиферации каллусов - среду Мурасиге-Скуга,включающую 1 мг/л 2,4-Д и 20 г/л сахарозы и культивируют в течение одного месяца при температуре 20-26 С и постоянном освещении 3000 Лк. Полезная модель поясняется изображениями, где на фиг.1 представлена диаграмма по накоплению биомассы каллусов различных видов и гибридов пшеницы в зависимости от концентрации сахарозы в питательной среде на свету на фиг.2 - диаграмма, 1642 характеризующая накопление биомассы каллусов различных видов и гибридов пшеницы в зависимости от концентрации сахарозы в питательной среде в темноте на фиг.3, 4 - клетки каллусов, растущих в темноте при 10 - ной концентрации сахарозы, фиг.3 - различные типы клеток неморфогенного каллуса фиг.4 упорядоченные клетки меристематической зоны без хлорофилла, ув х 40 на фиг.5, 6 - клетки каллусов,растущих в темноте при 20 - ной концентрации сахарозы, фиг.5 - меристематические клетки морфогеннго каллуса,фиг.6 участок формирования трехеидных структур, ув х 40 на фиг.7,8 - клетки каллусов, растущих в темноте при 30 - ной концентрации сахарозы, фиг.7 паренхиматозная клетка морфогенного каллуса,фиг.8 - упорядоченные клетки меристематической зоны без хлорофилла, ув х 40 на фиг.9, 10 - клетки каллусов, растущих на свету при 10 - ной концентрации сахарозы, фиг.9 - зона формирования хлорофилльных зерен,фиг.10 хлорофиллсодержащая область формирования трахеидных структур, ув х 40 на фиг.11, 12 - клетки каллусов, растущих на свету при 20 - ной концентрации сахарозы, фиг.11 - хлорофилльные зерна в клетках, фиг.12 - зеленая зона начала регенерации, ув х 40 на фиг.13, 14 - клетки каллусов, растущих на свету при 30 - ной концентрации сахарозы, хлорофиллсодержащие области формирования трахеидных структур и проводящих пучков, ув х 40. Способ осуществляют следующим образом. Культивируют каллусы, полученные из незрелых зародышей, изолированных на 12-14 день после опыления. Очищенные зерновки стерилизуют 70 этанолом в течение 7 минут с последующим троекратным промыванием автоклавированной водой. Зародыши эксплантируют на питательные среды Мурасиге-Скуга (МС). Культивирование каллусной ткани проводят в темноте при 26 С на агаризованной питательной среде МС, содержащей 2 мг/л 2,4-Д. Для более интенсивного роста каллусов через 2 недели культивирования их помещают на среду МС с 5 мг/л 2,4-Д. Через 20-25 суток каллусы каждого изучаемого вида пшеницы пересаживают на среду пролиферации каллусов (МС с добавлением 2,4-Д в концентрации 1 мг/л) оптимальную ( 5,6-5,7) с концентрацией сахарозы 20 г/л и культивируют в течение месяца при температуре 20-26 С и освещении 3000 люкс. Заключение о фотосинтезирующей способности каллусной культуры различных видов пшеницы делают по результатам оценки морфофизиологической характеристики,регенерационной способности и по результатам цитологической оценки препаратов, полученных из каллусных тканей изучаемых видов. Способ позволяет повысить фотосинтетический потенциал и, как следствие - регенерационную способность каллусных тканей различных видов пшеницы. Морфофизиологические особенности каллусной ткани у изучаемых видов и гибридов пшеницы в темноте и на свету различались на средах, отличающихся по уровню углеводного питания. На фиг.1, 2 представлены данные по накоплению биомассы каллусов различных видов и гибридов пшеницы, культивируемых на свету и в темноте в зависимости от количества сахарозы в питательной среде. Т.- мягкая пшеница, гексаплоид Т. эфиопская пшеница,возделывается в Эфиопии и Йемене, гексаплоид Т.- пшеница-двузернянка, полба,тетраплоид Т.- реликтовый вид пшеницы с компактным колосом, гексаплоид Т. и Т. х Т.- межвидовые гибриды. В соответствии с данными, представленными на диаграммах, при концентрации сахарозы 10 г/л накопление биомассы составило 0-22 у видов и 96-206 у гибридов. При концентрации сахарозы 20 г/л накопление биомассы, как правило, и у видов,и у гибридов пшеницы было наибольшим (83-117 у видов и 176-245 у гибридов) и снижалось до 2068 у видов и 164-222 у гибридов при повышении концентрации сахарозы в питательной среде до 30 г/л. Сравнительный анализ морфофизиологической характеристики каллусов, культивировавшихся в темноте и на свету, показал, что каллусы, растущие в темноте, имели неупорядоченную рыхлую структуру,были оводненными,легко распадающимися на отдельные клетки. Отдельные морфогенные каллусы имели участки средней плотности, с выраженными меристематическими очагами, но без зеленеющих зон (фиг.3-10). Однако, при 20 - ной концентрации сахарозы выявлены ярко выраженные зоны формирования морфогенных структур, которые в отсутствии освещения практически не содержали хлорофилла,но при выставлении каллуса на свет зеленели. Таким образом, изодиаметрическая форма клеток каллусов, интенсивно окрашенная цитоплазма и плотное прилегание клеток к друг к другу дают возможность характеризовать клетки каллуса как меристематически активные и о способности клеток каллусов при переносе их на свет к фотосинтезу. На свету, в процессе формирования зеленеющих участков морфогенного каллуса, в зеленеющих меристематических зонах обнаружены ярко выраженные хлорофиллсодержащие области (ХСО) формирования трахеидных структур и проводящих пучков, что указывает на начало процесса регенерации (фиг.11-14). Эти процессы были характерны для каллусов всех изучаемых видов, что позволяет сделать положительный вывод о возможности получения штаммов фотогетеротрофной каллусной культуры из гетеротрофных каллусов различных видов пшениц при изменении световых условий и углеводного состава питательной среды. Показано,что начало формирования хлорофилла в каллусе свидетельствует о начале морфогенеза. Оптимальными условиями интенсивного образования зеленых пигментов в клетках послужило снижение концентрации сахарозы в питательной среде до 20 г/л при стимуляции каллусных тканей освещением. ФОРМУЛА ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ Способ получения фотосинтезирующей каллусной культуры пшеницы, включающий стерилизацию зерновок и культивирование зародышей зерен на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,4-Д, при температуре выше 20 С, отличающийся тем, что очищенные зерновки стерилизуют 70 этанолом с последующим промыванием водой, 4 культивирование каллусной ткани сначала проводят в темноте при температуре 26 С на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2 мг/л 2,4-Д, через 2 недели культивирования их помещают на 20-25 суток на среду Мурасиге-Скуга,содержащую 5 мг/л 2,4-Д, а затем каллусы каждого вида пшеницы пересаживают на среду пролиферации каллусов - среду Мурасиге-Скуга,включающую 1 мг/л 2,4-Д и 20 г/л сахарозы и культивируют в течение одного месяца при температуре 20-26 С и постоянном освещении 3000 Лк.